【摘 要】
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研究目的:分析长链非编码RNA动脉粥样硬化斑块相关转录本（long noncoding RNA atherosclerosis plaque associated transcript,lncRNA-APAT）在无冠脉斑块患者、完全钙化斑块患者和混合斑块患者外周血中的表达差异,并阐明lncRNA-APAT通过竞争性结合microRNA-181a（miR-181a）对单核-巨噬细胞功能和动脉粥样硬化
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（81873492）； 中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目（2016-I2M-1-006）；
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研究目的:分析长链非编码RNA动脉粥样硬化斑块相关转录本（long noncoding RNA atherosclerosis plaque associated transcript,lncRNA-APAT）在无冠脉斑块患者、完全钙化斑块患者和混合斑块患者外周血中的表达差异,并阐明lncRNA-APAT通过竞争性结合microRNA-181a（miR-181a）对单核-巨噬细胞功能和动脉粥样硬化的调控机制。研究方法:1)自2017年10月至2018年12月期间纳入在中国医学科学院阜外医院疑为冠心病接受冠状动脉计算机断层血管造影检查的患者25例,包括无斑块健康对照组患者10例,完全钙化斑块组10例和易损斑块组5例;采用全转录组测序技术分析外周血全血中表达差异的lncRNAs,并通过实时定量PCR技术验证lncRNA-APAT的表达水平。2)lncRNA-APAT对单核-巨噬细胞功能的调控作用研究:采用RNA荧光原位杂交技术（FISH）分析lncRNA-APAT在单核-巨噬细胞中的定位。培养人单核细胞系THP-1细胞,使用脂多糖/干扰素-γ和白细胞介素～4诱导建立M1和M2型巨噬细胞极化模型;进一步采用慢病毒感染和Smart Silencer转染技术分别过表达和敲低lncRNA-APAT,利用黏附实验和油红O染色法检测单核细胞向内皮细胞的黏附能力和巨噬细胞脂质吞噬能力。利用实时定量PCR法检测单核-巨噬细胞的炎症因子、脂质代谢相关基因的mRNA表达水平。3)lncRNA-APAT与miR-181a的相互作用研究:采用生物信息学方法,利用miRanda数据库和TargetScan数据库分析lncRNA-APAT、miR-181a和核受体亚家族4,组A,成员3（NR4A3）的结合潜能,进一步通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验和实时定量PCR来验证三者之间的相互作用关系。研究结果:1)与无斑块健康对照组和完全钙化斑块组患者相比,lncRNA-APAT在在易损斑块组患者外周血中的表达水平显著升高（P<0.01）,其组织与细胞表达谱分析显示lncRNA-APAT在外周血白细胞和单核细胞中显著高表达。2)FISH实验显示其在巨噬细胞胞核与胞浆中均有表达;在细胞水平,过表达lncRNA-APA可促进M1型巨噬细胞中单核趋化蛋白-1（MCP-1）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素-6（IL-6）表达升高1.4倍、2.1倍和1.9倍（P<0.01）,同时促进单核细胞向内皮细胞黏附和巨噬细胞的脂质吞噬能力。反之,敲低lncRNA-APAT后,M1型巨噬细胞中MCP-1和TNFα的表达水平分别降低28%和61%（P<0.05）,单核细胞-内皮细胞间的黏附能力以及单核-巨噬细胞的脂质吞噬能力均显著降低（P<0.05）。3)生物信息学预测显示lncRNA-APAT与miR-181a序列存在结合位点,RIP实验和实时定量PCR进一步证实lncRNA-APAT和miR-181a可直接结合,NR4A3是miR-181a的直接靶基因。过表达lncRNA-APAT可促进M1型巨噬细胞中NR4A3的表达升高（P<0.01）,转染miR-181amimic显著抑制M1型巨噬细胞中NR4A3的表达（P<0.01）。此外,miR-181a可部分抑制lncRNA-APAT对巨噬细胞炎症反应、黏附和脂质吞噬功能的调控作用。结论:本研究发现lncRNA-APAT通过竞争性结合miR-181a调控NR4A3的表达,促进单核-巨噬细胞炎症反应、黏附和脂质吞噬能力增强,从而可能促进动脉粥样硬化进展和斑块不稳定。图[16]表[1]参[63]
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