莱芜猪和大白猪背最长肌miRNA与mRNA转录组测序及特征分析

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猪不但可以作为重要的农业经济动物为人类提供大量的肉类产品,而且还可以作为模式生物用于医学研究。由于遗传背景及人工选育方式的不同,造成了中外猪种在生产性状方面存在很大的差异。比如,莱芜猪作为我国特有的猪种资源,具有肉质优良的种质特性;而西方猪种虽然在生长速度方面具有优势,但是其较差的肉品质已不满足于消费者的需求。大量研究证实中外猪种间种质差异的形成与基因的差异表达有关,因此,从转录组水平探索中外猪种骨骼肌差异表达基因,对于解析品种间的差异及揭示形成该差异的分子机理具有重要作用。本研究选用生长速度慢但肉质优良的莱芜猪(Laiwu pig, LW)和生长速度快但肉质较差的大白猪(Yorkshire, YS)作为试验动物,利用高通量测序技术分析了莱芜猪与大白猪骨骼肌中的差异表达miRNA与差异表达基因,并对差异表达miRNA与基因进行筛选及信号通路富集,分析差异miRNA与差异基因在中外猪种中的功能。对于差异表达miRNA,采用生物信息学软件预测了这些miRNA可能的靶基因,构建了差异表达miRNA的调控网络图。为了验证高通量测序结果的正确性,我们采用qRT-PCR方法对差异表达miRNA与差异基因进行了定量验证,结果表明,高通量测序结果比较可靠。本研究的主要结果如下:(1)莱芜猪与大白猪骨骼肌小RNA测序分析分别构建了3个莱芜猪与3个大白猪的背最长肌小RNA文库,并利用RNA-seq技术对6个小RNA文库进行了测序,分析miRNA在莱芜猪与大白猪中的表达模式。结果表明,平均在每个莱芜猪的小RNA文库中获得了13,493,607的纯净测序reads,大白猪约为12,938,257。总共筛选出265个已知miRNA,其中有229个在6个文库中都表达;另外,还预测到94个新miRNA。对筛选出的359个miRNA进行表达分析,结果发现ssc-miR-1在两个品种猪中都是表达量最高的,而ssc-miR-194b-5p在两个品种猪中的差异倍数最大(6.35倍);此外,还发现有25个miRNA在莱芜猪与大白猪骨骼肌中是显著差异表达(q <0.05)。在25个差异显著的miRNA中,有10个miRNA在莱芜猪中上调表达,15个下调表达。为了验证测序结果的准确性,随机选取了16个miRNA进行qRT-PCR验证,qRT-PCR结果与测序结果基本一致。对差异表达miRNA的靶基因进行预测,结果获得了10,806个靶基因,而这些靶基因主要被富集到代谢过程等信号通路中。(2)莱芜猪与大白猪骨骼肌mRNA转录组测序分析为了研究莱芜猪与大白猪骨骼肌全基因组的转录谱,利用RNA-seq技术对构建的两个品种猪骨骼肌文库进行测序,测序结果显示在莱芜猪的文库中获得了40,498,476的测序reads,大白猪为59,072,892;其中,80%以上的测序reads可以比对到猪的基因组中。在两个文库中共检测到12种选择性剪切类型分析,其中以TSS(转录起始位点)与TTS(转录终止位点)两种剪切类型所占的比例最大,分别占到43%和40%以上。通过对测序reads进行比对分析,结果显示在莱芜猪与大白猪骨骼肌中有10,482个共表达基因,另有739个基因只在莱芜猪中表达,712个基因只在大白猪中表达。在两个品种猪中总共预测得到1,678个新基因,其中对应2,229个新转录本。为了更进一步研究这些差异基因的功能,对这些差异基因进行检验分析,结果表明在莱芜猪与大白猪骨骼肌中有178个显著差异表达的基因(q <0.05),其中,相对于大白猪,在莱芜猪中有98个差异基因为上调表达,80个下调表达。为了验证这些差异基因的正确性,随机选取了12个差异表达基因进行qRT-PCR验证,测序结果与qRT-PCR结果基本一致,两者具有很强的相关性(R2=0.93)。对差异表达基因进行功能注释,发现差异表达基因主要被富集到代谢通路,尤其是与脂肪代谢相关的信号通路,比如脂肪酸合成代谢通路等。(3)骨骼肌差异miRNA与差异基因关联分析为了从整个转录水平了解两个品种猪差异表达miRNA及差异基因的功能,对178个差异表达基因与25个差异表达miRNA进行关联分析,结果表明只有10个miRNA在关联分析中达到显著水平(q <0.05),上调表达4个、下调表达6个。关联分析结果表明,6个下调miRNA对20个上调差异表达基因具有调控作用;4个上调miRNA对20个下调表达差异基因具有调控作用。综上所述,本研究从miRNA和mRNA两个水平系统研究了两个品种猪骨骼肌差异表达基因,并对这些差异表达基因进行了功能注释、通路分析及互作网络调控分析等;并采用qRT-PCR方法验证了部分差异基因的表达水平。为研究不同表型猪的比较转录组学提供了宝贵的遗传资源与材料,并且有助于提高对猪转录组遗传结构的认识和理解。
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