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本论文以实验室保藏的能利用糖质基质直接发酵产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SYPS-062为研究对象,以分子生物学技术为基础,运用重组DNA技术等分子手段对L-丝氨酸代谢途径上的关键基因进行了分析,修饰,改造,构建了一株基因工程菌,并对该菌株进行了摇瓶发酵性能的初步研究。
3-磷酸甘油酸脱氢酶(3-PGDH)是L-丝氨酸的生物合成途径中的起始酶,其活性受到产物L-丝氨酸的反馈抑制作用。本论文运用PCR技术扩增出肽链C-末端缺失197个氨基酸的3-PGDH编码基因serAΔ591,通过在大肠杆菌中的表达测得其重组蛋白的比活力降低为原来的74.13％。比较了L-丝氨酸对基因serAΔ591及serA表达的重组3-PGDH的反馈抑制作用,结果显示serAΔ591基因编码的重组3-PGDH基本解除了高浓度L-丝氨酸对其酶活的抑制作用,为下一步研究工作奠定基础。
将基因serAΔ591及serA在谷氨酸棒杆菌SYPS-062中进行了增强表达,与出发菌株相比,来源于重组菌SYPS-062(pJC1-tac-serAΔ591)的3-PGDH比活力提高了47.42％,L-丝氨酸产量提高了8.63％,来源于重组菌SYPS-062(pJC1-tac-serA)的3-PGDH比活力提高了67.38％,L-丝氨酸产量仅提高了1.84％,发酵结果表明增强基因serAΔ591的表达更有利于L-丝氨酸产量的提高。
L-丝氨酸脱水酶(Ser-DH)是由基因sdaA编码,催化L-丝氨酸降解为丙酮酸,本论文利用交叉PCR获得基因sdaA同源片段,根据同源重组原理,将谷氨酸棒杆菌SYPS-062的关键基因sdaA进行敲除。sdaA基因缺失菌株和出发菌株发酵过程比较发现,sdaA基因缺失菌株生长缓慢,发酵周期延长,生物量降低了17.42％,L-丝氨酸积累量提高了3.61％,单位菌体产酸量提高了15.13％,耗糖速率量没有显著差异,以上结果表明改变L-丝氨酸代谢途径上关键基因的表达量确实能影响整个代谢流的分布。
基于以上研究,本论文在基因sdaA缺失的基础上,增强了基因serAΔ591的表达,构建了重组谷氨酸棒杆菌SYPS-062ΔsdaA(pJC1-tac-serAΔ591)。相比出发菌株,重组菌生长缓慢,发酵周期均延长,生物量降低了17.42％,发酵培养条件初步优化使其L-丝氨酸的积累量提高了23.18％,单位菌体产酸量(YP／X)提高了53.94％。同时考察了丙酮酸,玉米浆,酵母粉等对重组菌发酵产酸的影响,结果显示玉米浆能够促进菌体生长但不利于L-丝氨酸的积累,外源添加丙酮酸对菌株生长和产酸并未产生显著的影响,酵母粉的添加不利于菌株L-丝氨酸的积累。
由于微生物代谢网络自身存在着全局调控,从细胞代谢的全局来解析菌株的产酸机理,并对菌株进行合理的基因改造,构建出高产量的的L-丝氨酸基因工程菌株是未来发展的趋势。