论文部分内容阅读
朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus（Boisduval）,是一种危害多种经济作物的世界性农业害螨,并对我国的农林生产造成严重的威胁。目前,防治朱砂叶螨主要是通过化学药剂,但由于“3R”问题日趋严重,寻找新型的高效绿色杀螨剂已成为当务之急。实验室前期从黄花蒿等植物中提取分离得到的东莨菪内酯scopoletin已显示出对朱砂叶螨具有触杀、驱避、抑制产卵等效果,实验室前期探索发现东莨菪内酯可能是一种神经毒剂,但目前为止,具体的杀螨作用机制还不清楚。因此,探讨东莨菪内酯的具体杀螨作用机制将有助于以东莨菪内酯为模板进行药物修饰和改造设计,为开发安全、高效、新型的绿色杀螨剂提供理论指导。本研究通过探讨电压门控钙通道介导的东莨菪内酯引起朱砂叶螨钙稳态失衡机制入手,进行了电压门控钙通道基因的分子鉴定及与东莨菪内酯杀螨作用之间关系的研究,取得了以下主要研究成果:1.探讨了东莨菪内酯引起草地贪夜蛾细胞钙稳态失衡的影响,明确了质膜电压门控钙通道基因参与了东莨菪内酯的胁迫设置有钙外液环境和无钙外液环境,并用不同浓度的东莨菪内酯处理草地贪夜蛾细胞,探讨东莨菪内酯对细胞内游离钙离子浓度的响应。发现了在有钙外液环境下,1-100μmol/L的东莨菪内酯可引起细胞内游离钙浓度增加,且在1-100μmol/L浓度范围内,随着东莨菪内酯的浓度升高,胞内钙离子浓度随之上升,即胞内钙离子浓度与东莨菪内酯的处理浓度呈正相关,当1-100μmol/L浓度级别提升至1 mmol/L时东莨菪内酯可引起胞内钙离子相对荧光强度降低。在无钙外液下,1-100μmol/L的东莨菪内酯也可引起细胞内游离钙浓度增加,但增加幅度较有钙外液环境小,且二者之间有显著性差异。由于东莨菪内酯可引起昆虫细胞钙浓度升高,使得细胞钙稳态环境失衡,且这种失衡途径很可能是通过质膜电压门控钙通道介导的外钙内流导致。这为研究东莨菪内酯对朱砂叶螨电压门控钙通道介导的钙稳态失衡提供了理论指导。2.克隆鉴定了L型和T型电压门控钙通道TcL-VDCC、TcT-VDCC的各亚基全长,并分析了其在不同螨态的表达模式和东莨菪内酯胁迫下的表达模式通过分段克隆得到了朱砂叶螨L型和T型钙通道TcL-VDCC-α1、TcT-VDCC-α1的全长,同时克隆了其辅助亚基TcL-VDCC-β、TcVDCC-α2δ并将其序列提交到NCBI,GenBank登录号分别为MK213369、MK256354、MK372341、MK388861;通过分析其结构域发现TcL-VDCC-α1具有典型的电压门控钙通道的结构特性,还具有IQ结构域等L型钙通道特有的结构域;并且通过序列比对、进化分析表明TcL-VDCC、TcT-VDCC各亚基在进化位置上与二斑叶螨亲缘关系最近,并且与蛛形纲聚类到一个分支。不同螨态的表达模式结果显示,这四条基因在所有螨态都有表达,且在幼螨期显著高表达。TcL-VDCC-α1、TcT-VDCC-α1在不同浓度的东莨菪内酯的胁迫表达模式中分析表明在24h和48h处理后其mRNA表达被上调,显示了TcL-VDCC、TcT-VDCC在东莨菪内酯的胁迫处理过程后产生了表达响应。3.利用RNAi验证了TcL-VDCC、TcT-VDCC基因在东莨菪内酯的杀螨作用中的功能合成了TcL-VDCC、TcT-VDCC的dsRNA片段（dsTcL-VDCC、dsTcT-VDCC）,用饲喂法将其导入朱砂叶螨体内,48h后检测沉默效率分别为:55.40%和56.70%;东莨菪内酯的敏感性检测表明,用LC30的东莨菪内酯处理饲喂了dsTcL-VDCC、dsTcT-VDCC的朱砂叶螨,48h后的致死率分别为:11.20%、10.30%。LC50的东莨菪内酯处理饲喂dsTcL-VDCC、dsTcT-VDCC的螨,48h后的致死率分别为:17.67%、12.30%。这表明了沉默了TcL-VDCC、TcT-VDCC的表达后降低了朱砂叶螨对东莨菪内酯的敏感性,并且可能是东莨菪内酯杀螨作用的潜在靶标之一。4.利用同源建模和分子对接技术探索了东莨菪内酯与TcL-VDCC的可能结合位点利用同源建模技术以r Cav1.1的晶体模型为模板构建了朱砂叶螨TcL-VDCC的三维结构模型;通过分子对接技术探索了东莨菪内酯小分子化合物与TcL-VDCC的三维结构模型在活性口袋Pocket1的结合构象,结果显示,东莨菪内酯与TcL-VDCC Pocket1的结合能为-6.771 Kcal/mol,并且东莨菪内酯与Pocket1上的1099位的天冬酰胺（Asn）和1171位的丝氨酸（Ser）结合;同时用特异性钙通道阻滞剂硝苯地平进行了与TcL-VDCC Pocket1的结合,结果显示,硝苯地平与TcL-VDCC Pocket1的结合能为-7.662 Kcal/mol,硝苯地平与TcL-VDCC三维结构模型上的1171位和1517位的丝氨酸（Ser）结合。综上所述,本研究首先参考草地贪夜蛾细胞探讨了东莨菪内酯引起昆虫细胞钙稳态的影响及其可能的机制,进而探讨了由电压门控钙通道介导东莨菪内酯引起朱砂叶螨钙稳态失衡的机制,初步明确了电压门控钙通道TcL-VDCC、TcT-VDCC在东莨菪内酯对朱砂叶螨的作用机制中所起的作用,为最终明确东莨菪内酯的作用机理提供了新的见解及思路。