论文部分内容阅读
恶性肿瘤由于其高死亡率已严重威胁人类的健康和生命。提高恶性肿瘤诊断的准确率对于增加患者的生存率具有非常重要的意义。目前，免疫组织化学作为一种分子诊断方法，在肿瘤的诊断中得到了广泛的应用。但是免疫组织化学方法仍然存在抗体生产成本高、批间差异大等缺陷。核酸适配体（Aptamer）作为一类功能与抗体类似的配体分子，具有易合成、易修饰、批间差异小、亲和力高、特异性强、免疫原性低、能快速渗入组织等特点，有望为肿瘤的诊断提供新的理想工具。基于此，本文以肝细胞肝癌（SMMC-7721）为研究对象，以其特异性核酸适配体ZY1为靶向识别分子，设计和构建了两类核酸适配体探针，并用于SMMC-7721肝癌组织样本的荧光染色研究。具体工作包括以下3个方面：1. SMMC-7721肝癌组织切片类型的选择。为找到合适的组织切片类型，利用6-羧基荧光素（FAM）标记的ZY1（FAM-ZY1）分别对福尔马林固定的石蜡组织切片，丙酮、卡诺、Clarke、95%酒精固定的冰冻组织切片和快速冰冻组织切片进行荧光染色研究。研究结果表明， ZY1能有效用于SMMC-7721肝癌快速冰冻组织切片的荧光染色。2.单荧光标记的核酸适配体探针用于SMMC-7721快速冰冻组织切片的荧光染色。为避免组织自发荧光的干扰，采用青色素5（Cy5）对ZY1进行标记，构建了具有近红外荧光信号的分子探针Cy5-ZY1。研究结果表明，Cy5-ZY1探针不仅能高特异性地对靶肿瘤组织进行荧光染色，而且能高效区分来源不同的肝癌组织；此外，基于Cy5-ZY1探针的组织切片荧光染色结果可在10min内获得。这一研究为基于cell-SELEX技术筛选的特异性核酸适配体用于肝癌的病理诊断提供了有力支持。3.激活式核酸适配体探针用于SMMC-7721快速冰冻组织切片的荧光染色。为解决上述单荧光标记的核酸适配体探针存在的操作繁琐、灵敏度有限等不足，将ZY1设计为一种基于靶细胞触发构型变化的激活式核酸适配体探针（Activatable Aptamer probe, AAP）。结果表明，探针能高特异性地指示靶肿瘤细胞的存在，能有效检测低至171个SMMC-7721细胞数的体外样品。利用该激活式探针实现了对靶肿瘤组织高特异性、快速、免洗的荧光染色。这种简便的、特异的、免洗的组织切片荧光染色方法有望为肿瘤的临床诊断提供新思路。