乙型肝炎病毒聚合酶新功能区的发现和意义研究乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染在全球超过3亿人。HBV属于嗜肝DNA病毒科，该科具有部分双链环状的DNA基因组。HBV通过特有的逆转录反应进行复制。HBV编码的聚合酶／逆转录酶(Reverse transcriptase，RT)的结构和功能在其复制过程中起重要作用。但是，至今具有酶活性的HBV RT仍不能足量表达用于体外生化研究和晶体学分析。此外，也没有合适的体外感染系统用于分析复杂的HBV复制周期。通过对分离自乙肝病人的两株B基因型HBV的全基因组克隆和基于细胞转染的复制效率测定，我们曾报道HBV RT第306位脯氨酸(rtP306)置换为丝氨酸或其他氨基酸时，大部分变异体的复制效率下降。为阐明这些变异体复制效率下降的机理，我们首先构建一C基因型毒株的rtP306变异体并转染Huh-7细胞，然后比较变异体与原毒株的复制能力、转录水平和pgRNA包装效率。通过基于细胞转染的复制效率测定发现rtP306变异体复制效率下降，而且RT变异体与RT缺失复制子rtW58~*的反式补充实验也证实这一现象。为深入了解复制效率下降的机理，首先分析变异体和原毒株的转录水平，结果显示各rtP306变异体具有相似的转录水平。而且Western印迹显示rtP306氨基酸置换并不影响RT稳定性。我们通过特异性的pgRNA包装实验和内源性聚合酶反应分析HBV RT的两大主要功能：参与pgRNA包装和催化核苷转移合成子代病毒DNA。pgRNA包装效率用细胞内衣壳颗粒量校正后的衣壳颗粒内pgRNA量表示，细胞内衣壳颗粒用抗衣壳蛋白抗体进行Western印迹测定。包装实验结果显示大部分rtP306变异体的pgRNA包装效率下降。这一结果也被内源性聚合酶反应所确认。同时，通过内源性聚合酶反应发现一些rtP306氨基酸置换导致RT核苷转移酶活性下降。基于上述发现，我们推测除了rtP306外，rtP306附近的氨基酸(rt304-311)对HBV复制同样重要。通过将rt304-311位氨基酸置换为丙氨酸或苯丙氨酸构建变异体并测定其复制效率，我们发现rt304-311置换确实导致HBV复制效率明显下降。相关机理不是转录水平或RT稳定性改变而是pgRNA包装效率下降。作为对照，远离rtP306的氨基酸(rt336和rt346)置换不影响病毒复制效率。据我们所知，这是首次报道rt304-311氨基酸保守在pgRNA包装中起重要作用。此外，与原毒株相比，rtY305A变异体对抗病毒药阿德福韦的敏感性下降。阿德福韦据报道作用于HBV RT“手掌”域的酶活性中心，而rtY305置换位于HBV RT“拇指”域，因此药敏实验提示rt304-311氨基酸置换可能改变HBV RT构型从而导致与抗病毒药的亲和力下降。此外，通过生物信息学方法分析rt304-311对HBV RT和HBV复制的作用，结果显示：1)预测rt304-311位于HBV RT“拇指”域一螺旋-转角-螺旋结构的转角上，这一螺旋-转角-螺旋结构称为螺旋钳基序；2)转角氨基酸在已报导的基因型A-H毒株中非常保守；3)部分HBV RT转角氨基酸在逆转录病毒RT和丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶的螺旋钳基序中保守。螺旋钳基序是真核生物、细菌和病毒的核酸聚合酶拇指域中一共同的结构元件，在聚合反应时可结合核酸模板和引物。因此，我们通过生物学和结构生物信息学方法确认了HBV RT螺旋钳基序转角(rt304-311)，该转角作为一新功能区可能通过控制HBV RT与核酸的亲和力来调节HBV pgRNA包装效率。人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)是逆转录病毒科慢病毒属的研究模型。与HBV相似，HIV也通过特有的逆转录反应进行复制。为研究HIV RT螺旋钳基序转角是否在HIV复制中起重要作用，以一HIV前病毒质粒基础上将HIV RT转角置换为丙氨酸。通过单周期感染实验检测各变异体的复制能力。初步结果显示HIV-1转角变异体(rtY271A和rtl274A)不能在Jurkat细胞内复制。而且，HIV-1 RT转角变异体(rtY271A和rtl274A)与DNA模板／引物结合能力下降。总之，HBV RT和HIV RT螺旋钳基序转角在病毒复制过程中起重要作用并且可以作为抗病毒药物设计的新靶点。目前，已注册的抗HBV药物如拉米呋啶，阿德福韦酯和恩替卡韦都是作用在HBV RT催化中心的核苷(酸)类似物。长期使用这些药物将导致耐药株的出现。因此迫切需要发展新的抗HBV药物。在筛选针对HBV RT和HIV RT螺旋钳基序转角的化合物时，我们发现一种非核苷类似物KM-1，2-萘磺酸，4-羟基-7-[[[[5-羟基—6-[(4-肉桂酸苯基)偶氮]-7-磺酸-2-萘基]氨基]羰基]氨基]-3-[(4-肉桂酸苯基)]偶氮(2-naphthalenesulfonic acid，(4-hydroxy-7-[[[[5-hydroxy-6-[(4-cinnamylphenyl)azo]-7-sulfo-2-naphthalenyl]amino]carbonyl]amino]-3-[(4-cinnamylphenyl)]azo))曾被报道通过与已知非核苷类似物不同的机制有效地抑制HIV RT。而且，据推测，KM-1针对HIV RT的“拇指”域。因此，我们采用多种方法评价KM-1的抗HBV活性。通过内源性聚合酶反应发现KM-1抑制野生型HBV RT及其对三磷酸拉米呋啶耐药的变异体rtL180M／M2041，50％抑制浓度分别为2.6μM和0.5μM，因此KM-1通过与三磷酸拉米呋啶不同的机制抑制HBV RT。通过基于细胞转染的复制效率测定发现KM-1抑制野生型HBV及其变异体rtL180M／M2041在细胞内复制，50％抑制浓度分别为31.2μM和9.5μM。此外，KM-1有一定细胞毒性，50％细胞毒浓度为105μM。因此，设计能与RT拇指区甚至拇指区螺旋钳基序转角结合的新化合物有望发展成新的抗HBV或抗HIV药物。