第一部分CYP17基因在前列腺癌细胞中表达水平的研究研究背景及目的RNAi是指双链RNA(dsRNA)导入细胞后特异性地阻与其同源的基因结合,阻断目标基因表达的现象。RNAi是研究基因功能,基因治疗的重要工具,目前已应用于恶性肿瘤、病毒感染性疾病基因治疗的研究。与腺病毒、逆转录病毒等其它病毒载体系统相比,慢病毒不仅能转导分裂细胞,还能转导非分裂期细胞,将外源性基因整合到靶细胞的基因组当中,从而实现对靶细胞中的目的基因稳定、持续的沉默。选用慢病毒(Lentivirus)做为载体系统来研究RNAi对细胞中基因的干扰过程具有巨大的潜力和明显的优势。在20世纪80年代的研究中发现,细胞色素P450c17α酶有两种同工酶,分别是17、20裂解酶和17a羟化酶,这两种同工酶主要在合成睾酮等性激素的过程中发挥重要作用。在后来的研究中,研究人员定位了编码细胞色素P450c17α酶的基因并命名为CYP17基因。CYP17基因位于染色体10q24.3,编码细胞色素P-450c17α酶,后者介导着17、20裂解酶和17a羟化酶的活性,他们是由胆固醇合成睾酮过程中的两个关键酶,在人体性激素的合成中起非常重要的作用,在前列腺肿瘤的发生、发展及转移中起重要作用。本文从mRNA和蛋白水平研究CYP17基因在前列腺癌中的表达,观察其与临床病理学指标的关系；我们利用RNAi降解CYP17mRNA,使CYP17基因所编码蛋白的合成明显降低,降低CYP17基因蛋白对其下游基因的调控,在很大程度上阻断了肿瘤细胞的应答,建立一种基因修饰前列腺癌治疗策略,提高前列腺癌的治疗效果。并建立人裸鼠肿瘤模型,慢病毒介导的前列腺癌细胞CYP17基因表达抑制在体内的抑瘤作用,进一步验证CYP17基因表达与前列腺癌发生发展的关系,为探讨以CYP17为靶标建立前列腺癌早期诊断和基因治疗方法提供理论依据和技术对策。研究方法1. RT-PCR分别取36例新鲜前列腺癌标本及前列腺增生标本,所有标本均经病理证实。其中平均年龄62岁。按照Trizol试剂盒的说明提取前列腺癌组织及前列腺增生组织中的总RNA,用随机引物Oligo dT按照试剂盒说明书反转录(RT)合成cDNA第一条链,RT反应产物用作PCR的模板DNA,使用特异性引物进行PCR。β-actin基因作为内参照。取10μ l PCR产物在2%琼脂凝胶电泳,紫外灯下观察电泳带,凝胶成像分析系统扫描拍照。分析读取各条带灰度,取得目的基因与表达恒定的作为内参的管家基因条带灰度的比值。通过在半定量水平测定36例前列腺癌组织和前列腺增生组织中的CYP17mRNA表达的相对水平,观察其与临床病理学指标的关系。统计学处理：每个样本重复测定3次,实验结果以均数±标准差(X±s)表示,采用SPSS15.0统计软件包进行配对t检验、方差分析、χ2检验进行统计学处理。2.免疫组化检测前列腺癌细胞中CYP17蛋白的含量由山东省立医院病理科提供的36例,所有标本均经10%甲醛处理、常规石蜡包埋的前列腺癌组织切片。免疫组化按武汉博士德生物公司SABC免疫组化染色试剂盒说明书操作。多抗稀释浓度为1：500。免疫组织化学染色结果判定在高倍镜下进行。染色强度不着色、阳性面积0-25%为(0-1分)记为(-)；弱着色：阳性面积25-50%(1-2分)淡黄色(0-1分)记为(+)；中着色：阳性面积50-75%(2-3分)黄色(1-2分)记为(++)；强着色：阳性面积>75%(4分)棕黄色(2-3分)记为(+++)。统计学处理：镜下直接计数,每片10×10倍镜下随机计数3个视野,染色强度得分与阳性面积得分相乘之和除以3为该片表达情况数据,用x2检验、Fisher’s精确概率法进行统计分析。P<0.05被认为有显著性差异。3. Western Blot检测前列腺癌组织中CYP17表达标本经常规处理后,剪碎,用组织裂解液RIPA制备匀浆,经SDS-PAGE电泳、电转膜及Western Bloting,观测癌组织和前列腺增生组织中CYP17蛋白表达水平。研究结果1.36例前列腺癌标本中CYP17mRNA表达丰度以均数±标准差表示,癌组织为1.109±0.52,前列腺增生组织为0.311±0.21,前列腺癌组织CYP17mRNA表达量较前列腺增生组织显著升高,差异显著(P<0.01)。比较两组前列腺癌部分临床指标的关系,发现两组在年龄之间差异无显著意义(P>0.5)、在病理类型之间差异无显著意义(P>0.5)。2.免疫组化显示CYP17主要存在于细胞浆中,绝大多数肿瘤组织细胞内可见棕褐色深染颗粒,正常组织细胞内染色较浅,结果显示前列腺癌组织中的CYP17表达明显高于前列腺增生组织(P<0.01)。3.Western Blot显示前列腺癌组织中CYP17蛋白表达量明显高于前列腺增生组织。研究结论本文证明前列腺癌组织中CYP17基因表达增高。上述研究结果提示CYP17基因表达可作为前列腺癌病因、基因诊断及基因治疗方法研究的靶标。第二部分构建RNAi慢病毒载体系统并筛选有效靶点研究方法CYP17RNA干扰慢病毒载体的构建：采用Invitrogen公司的BLOCK-iT Lentiviral RNAi Expression System,构建入门克隆和病毒包装目的质粒。RNA干扰慢病毒的生产和滴度测定：四种质粒共转染293FT的方式生产病毒,病毒功能滴度测定用转导试验,分子滴度测定用定量PCR技术。进行基因稳定沉默细胞株的筛选：慢病毒转导DU145和PC-3细胞后用Blasticidin筛选,建立CYP17基因沉默细胞株和对照细胞株。进行细胞瞬时转染实验。研究结果成功构建CYP17RNAi入门质粒,两个针对不同序列的RNAi质粒均有显著的RNAi效果,CYP17mRNA抑制效果分别达87%和76%。包装产生的浓度为3×1010copies/ml的Lenti6-CYP17和Lenti6-GFP转导DU145和PC-3细胞的功能滴度分别为：1.9×106TU/ml、1.3×106TU/ml和1.8×106TU/ml、1.3×106TU/ml。成功建立CYP17基因沉默的DU145/CYP17(-)和PC-3/CYP17(-)细胞,同时建立非特异性对照细胞DU145/NS和PC-3/NS。研究结论通过该部分试验,我们成功构建了三组特异性shRNA慢病毒载体,RNAi慢病毒的包装也同时完成,并在293T细胞中完成病毒包装后的滴度标定。我们又从三组重组载体中筛选出高效率的靶点,并明确不同MOI值的非特异的毒性差异,为下一步选用最高效率的重组载体对前列腺癌细胞进行转染提供了可靠的依据第三部分慢病毒介导的前列腺癌细胞CYP17基因表达沉默研究方法培养生长状态良好的DU145细胞,病毒感染前一天将目的细胞分入6-well培养板培养,感染当天按实验设计的组别分别加入RNAi慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察GFP表达情况,感染5天后收集细胞,采用Realtime PCR的方法检测目的基因的mRNA表达情况,并提取蛋白,采用Western Blot的方法检测目的基因的蛋白表达情况,进而判断该靶点的干扰效果。之后检测了对基因沉默后对前列腺癌细胞生长抑制的情况,(1)CCK-8试剂盒方法检测RNA干扰CYP17基因后细胞生长水平(2)流式细胞仪检测RNA干扰CYP17基因后细胞凋亡水平变化。研究结果干扰组的细胞生长曲线较其它两组细胞(空白对照组以及无意义序列重组载体组)出现明显的压低,同时细胞活力明显降低,这一结果提示在CYP17基因被干扰后,前列腺癌细胞的增殖能力明显减弱,肿瘤细胞的生长能力被抑制。通过流式细胞术检测转染沉默后细胞群体中各时期细胞的比例,我们发现,与其它两对照组比较,在CYP17基因被沉默后,DU145细胞凋亡率大幅度增加,出现了特征性的凋亡峰。研究结论我们采用了慢病毒载体系统针对CYP17基因构建了shRNA重组载体,并成功在人前列腺癌细胞株中实现了高效、特异、稳定的沉默效果。该基因被沉默后,我们看到前列腺癌增殖周期延长,凋亡比例大幅增加等生物学行为的变化。第四部分慢病毒介导的CYP17基因沉默对前列腺癌细胞抑制作用的体内研究研究方法应用细胞移植法把浓度为6×107个/m1人前列腺癌细胞100μ l每只接种于BalB/c(nu-/nu-)裸鼠一侧皮下,成功建立前列腺癌裸鼠模型,在移植瘤直径4-6mm左右时从成瘤裸鼠选取18只,随机分为空白对照组、慢病毒载体对照组和CYP17重组病毒载体对照组,每组6只。将本实验室构建的腺病毒介导的CYP17重组病毒载体对照组(病毒含量5×108pfu)、慢病毒空载体(病毒含量5×108pfu)、PBS各0.1ml采用瘤体内注射法注射到瘤体内,24h一次,共3次,注射后每三日一次测量肿瘤最长径及最短径,计算每组肿瘤平均体积,绘制肿瘤生长曲线。研究结果应用细胞接种法接种后建立裸鼠皮下移植瘤模型,肿瘤生长潜伏期10-14天,成瘤率100%,肿瘤生长较为均一,动物生长状况良好,连续治疗观察4周,动物无死亡。CYP17重组慢病毒载体组和慢病毒载体对照组都有GFP荧光表达,空白对照组无GFP荧光表达。治疗后第28天空白对照组和慢病毒载体对照组裸鼠移植肿瘤平均体积分别为976mm3、882mm3；而CYP17重组慢病毒载体组移植肿瘤平均体积为312mm3,远小于前两组。通过描绘肿瘤生长曲线,计算得出空白对照组和腺病毒载体对照组的肿瘤生长速率分别为41mm3/day和36mm3/day；而CYP17重组慢病毒载体组的肿瘤生长速率为12mm3/day。研究结论建立裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射CYP17重组慢病毒载体组的生长速度较慢病毒载体对照组和空白对照组明显减慢。CYP17重组慢病毒载体组可抑制已形成的裸鼠前列腺癌移植瘤在裸鼠体内的生长和CYP17高表达。