背景与目的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）感染是一个重大的公共健康问题，全世界约有4亿人慢性感染。乙型肝炎病毒（hepatiis B virus，HBV）高度流行区主要分布在南非、中国、东南亚、地中海地区。慢性乙型肝炎治疗，抗病毒是关键，将病毒复制控制在一个最低的水平，从而减缓或中止肝脏疾病的进程，预防并发症的出现。目前抗病毒治疗的药物主要有两种类型，IFN-γ和HBV逆转录酶抑制剂（NucleosideReverse Transcriptase Inhibitors，NRTIs）。IFN-γ的效果有限，约40%的患者对其低应答，NRTIs长期使用可产生耐药突变株及停药反弹。目前HBV逆转录酶抑制剂分为三种结构类型：L-核苷类似物，无环腺苷膦酸酯，脱氧鸟苷类似物。目前有5种NRTIs在美国和欧洲被批准用于HBV治疗：拉米夫定（LAM）、阿德福韦酯（ADV）、恩替卡韦（ETV）、替比夫定（LDT）和替诺福韦（TDF）。LAM和ADV是CHB治疗的一线药物。大部分情况下，CHB的治疗使用单个NRTIs在短期内可快速抑制HBV复制，但长期使用，由于药物耐药HBV株的出现，会出现一种不佳的治疗效应，药物耐药作为治疗失败的最重要的因素出现。NRTIs治疗失败带来一个重要的临床挑战，限制了后续治疗的选择范围，因此抗病毒药物耐药受到广泛关注。ADV是一个对HBV野生株和LAM耐药株均有效的核苷类似物，在LAM补救治疗中起重要作用。ADV耐药出现比LAM耐药晚，但在LAM治疗失败的患者中，阿德福韦酯治疗时耐药性的发展非常迅速。单一氨基酸的变化，rtN236T和/或rtA181V/T置换，均足以导致ADV临床治疗失败，是ADV耐药的典型位点。其他与ADV治疗失败有所关联的逆转录区序列位点改变，包括rtL80V/I、rtV84M、rtV214A、rtS85A、rtQ215S、rtE218G、rtP237H和rtN238T/D/H，可单独出现或联合rtN236T与rtA181V/T出现。HBV多聚酶改变在ADV治疗失败中仅仅在少数的临床分离中被检测出，怀疑有更多的未知因素造成阿德福韦酯临床耐药。影响NRTIs治疗应答和耐药发生的因素很多，HBV基因型是常见被报道的因素之一。很多研究的结果也有所差异。目前普遍认为HBV基因型对耐药的出现和耐药突变的类型有一定的影响。LAM的耐药突变YMDD与HBV基因型相关的报道较多，认为HBV基因型对YMDD突变发生率没有太大的影响，但影响YIDD/YVDD变异的类型。在ADV治疗中，有研究者认为其耐药突变的发生率在基因型A和D患者中无明显差异，也有研究者认为ADV的耐药或许主要出现在B和D基因型中。目前尚有争议。HBV自然变异速率较RNA低，而核苷类似物干预加速了病毒变异，并特异性选择逆转录酶区。HBV在阿德福韦酯干预下出现的变异是否会打破与宿主长期共进化的免疫平衡，导致细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）表位的变化，从而与肝炎的发作相关。目前有报道认为RT区的变异能够引起免疫反应的变化，如rtM204I基础上联合rtL180M变异可能导致突破后肝炎，但相关的研究还较少，特别是对ADV耐药变异带来的免疫影响。由于ADV基因耐药患者出现较少，对该类患者的研究样本普遍偏小，多为研究ADV应答效果的附带结果，本研究花长时间收集了较大的样本量，更详细的分析ADV临床应答不佳的原因和耐药突变类型与HBV基因型以及其他临床因素的关系，特别是rt181的变异类型的影响因素及对HBsAg的影响，目前国内外尚缺乏相关资料。本实验在此基础上进一步研究ADV耐药株的表位漂移情况。结果1.161例ADV临床耐药的CHB患者进行了RT区测序，135例患者为ADV治疗中出现病毒反弹患者，26例为ADV早期不应答患者。在发生病毒学反弹患者中，ADV基因耐药组的年龄42.20±7.99岁，和ADV治疗疗程30.01±11.03月，均比无基因耐药组高（年龄33.57±9.69岁，治疗疗程19.97±10.86月）（P=0.000），无基因耐药组HBeAg阳性率85.2%高于基因耐药组56.8%（P=0.000）。ADV早期无应答患者大多（24/26）未检出基因耐药（P=0.000）。其中在74例ADV治疗过程中发生病毒学反弹并检测出基因耐药的患者中，有19例同时发生rt181+rt236变异，余55例为单一rt181或者rt236位点变异患者，将发生不同基因耐药位点突变的12个可能影响因素进行单因素分析和多因素回归分析，HBV基因分型和合并肝硬化影响两个位点的选择（P=0.002和P=0.026）。 Rt236位点变异组中88.9%为基因型B，与重庆地区HBV基因型的分布及ADV临床耐药、基因耐药、rt181变异组差异显著（P＜0.05）。在48例ADV治疗过程中发生病毒性反弹和检测出rt181位点变异的患者中，将可能影响rtA181T、rtA181V变异类型的选择因素进行单因素分析和多因素回归分析，rtN236T变异和ADV治疗疗程均为rt181位点突变类型的影响因素（P=0.007，P=0.024）。RtN236T变异与rtA181T同时出现更为常见。出现rtA181V变异患者的治疗疗程要长于rtA181T患者。2.161例接受ADV治疗并发生临床耐药患者，rt238位点为N氨基酸者共46例，占28.6%，为H的有105例，占65.2%，为T的9例，占5.6%，另有1例为罕见的rtN238Q。在基因耐药和无基因耐药患者中，HBV氨基酸序列的rt238位点氨基酸差异无统计学意义（P=0.709）。Rt238的三种不同类型氨基酸在HBV基因型中差异显著（χ~2=83.874，P=0.000）。RtN238H主要出现在基因型B患者中，rtN238主要出现在基因型C患者中，而rtN238T的HBV序列全部为基因型C。Rt238的氨基酸类型在ADV突变的三种模式rt181、rt236、rt181+rt236中有显著差异（χ~2=25.640，P=0.000）。采用偏相关分析，控制HBV基因型，rt238氨基酸类型与三种突变模式无明显相关（P=0.347）。在ADV单药治疗和LAM-ADV序贯治疗组中，rt238的氨基酸差异无统计学意义（χ~2=1.262，P=0.532）。且在6例ADV治疗患者治疗前后，rt238位点的氨基酸均无变化，其中有2例为rtN238H，4例为rtN238。对照52例LAM耐药和26例未经治疗的CHB患者，rt238位点氨基酸类型分别在LAM组和未经治疗的野生株中分布与HBV基因型均有关（P=0.000）。HBV基因型在未经治疗患者中与LAM单药耐药组的差异有统计学意义（χ~2=8.751，P=0.003），而与ADV单药耐药组无显著差异（χ~2=0.573，P=0.449）。Rt238位点的氨基酸类型在未经治疗组、LAM单药耐药组、ADV单药耐药组中分布无显著差异（P=0.326）。3. LAM单药诱导rt181变异的7例患者中，以rtA181T为主，有5例，占71.4%，ADV单药诱导的15例rt181变异患者中，8例是rtA181V型，7例rtA181T，两组间的差异无统计学意义（χ2=4.139，P=0.067）。比对两治疗组患者的序列，发现rt223位点氨基酸类型与治疗组有关，在两个治疗组间有统计学差异（χ2=5.455，P=0.020），在ADV治疗组中，rtA223有12例，占80%，在LAM治疗组中，rtS223有5例，占71.4%。采用偏相关分析，控制HBV基因型的影响，rt223位点氨基酸类型同样与治疗组存在正相关关系（P=0.013）。在不同基因型中rt221、rt223、rt224、rt238位点的氨基酸类型均有统计学差异（P=0.001；P=0.010；P=0.035；P=0.011）。4.在15例rt181变异发生后的血清中，在不同基因型中HBsAg差异显著（P=0.037），HBsAg半定量在7例基因型B患者中为8341.57±1510.01S/COI，在8例基因型C患者中为5688.05±2651.79S/COI。同时发生rt236变异的血清中HBsAg水平明显高于无rt236变异患者（P=0.008）。两例rt181不同变异类型患者多个变异前后时相点分析，发生rtA181T变异的患者,发生变异时，HBsAg的升高幅度较小。发生rtA181V变异的患者，各个时相点的HBV DNA对数值与HBsAg之间显著相关（P=0.001），发生变异时相点HBV DNA与HBsAg的变化趋势相反。5.2例ADV耐药的HLA_A2型患者进行治疗前后的HBV全序列表位预测。两例患者均在强抗原性区域LHB346-354、LHB382-390、 LHB388-396出现了氨基酸的改变。针对LHB346-354表位的变化，本研究利用来源于蛋白质晶体结构数据库的HLA-A2计算机分子模型，对变异前后的3条表位肽与HLA-A2的结合情况进行了分子动力学模拟，变异后表位WFSLLVPFV与MHC分子形成了更强的氢键作用。三个肽与MHC分子间亲和力由大到小为WFSLLVPFV＞WLSLLVPFV＞RLSLLVPFV。LHB346-354、LHB382-390、 LHB388-396三个表位变异前后九肽进行CTL细胞表位功能验证，检测的表位肽均高于阴性对照，2号患者的LHB346-1表位甚至高于阳性对照。2例HLA_A*1101型ADV耐药患者，预测X87-95是CTL表位的可能性大。LHB346-354表位未预测出，将该表位与MHC分子对接（HLA_A*1101），发现WFSLLVPFV与MHC分子也有较强的亲和性。结论1. ADV临床耐药患者中大多无ADV基因耐药突变，提示除耐药突变外其他因素可能影响ADV应答。2.通过比较rt181和rt236位点单一变异的ADV治疗患者临床和病毒学因素，提示HBV基因型是选择ADV耐药突变位点的重要影响因素。3.首次提出rt181突变类型受ADV治疗疗程和rt236位点变异的影响。RtN236T在rtA181T突变患者中更为常见，rtA181T突变在ADV治疗中出现较rtA181V早。4. RtH238是重庆地区常见的病毒株，与治疗无关，与HBV基因型B有关。5. LAM单药诱导的rt181位点变异以rtA181T为主，ADV单药诱导的rt181变异以rtA181V为主。6.首次发现在不同药物诱导的rt181变异患者中，rt223位点氨基酸类型与治疗药物有关，提示其可能影响病毒对核苷类似物的应答。7. Rt221、rt223、rt224、rt238位点均为HBV基因型依赖位点。8. HBsAg滴度与HBV DNA水平相关，rt181耐药突变在一定程度上影响HBsAg的表达。9. LHB346-354、LHB382-390、 LHB388-396经预测和验证为HLA_A2的CTL细胞表位，且易于在ADV治疗中出现氨基酸置换，从而影响免疫应答。10. LHB346-354（重叠rt181变异位点）分子模拟提示也是HLA_A11的CTL细胞表位。