论文部分内容阅读
氧化应激为糖尿病肾病(DN)的重要发病机制之一，它可以促进DN的发生和发展。核因子相关因子2(Nrf2)作为转录因子，可以增加多种内源性抗氧化蛋白的转录及表达，如血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶-1(NQO1)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)等。有研究证明萝卜硫素(SFN)可以通过上调Nrf2改善DN，但是Nrf2的哪个下游抗氧化蛋白是SFN的主要保护途径尚不清楚。另外，实验证明给予大鼠SFN干预后，肝脏基因表达上调最显著的是金属硫蛋白(MT)，上调了10倍以上；MT作为强效内源性抗氧化蛋白，可以显著减轻氧化应激，延缓DN的病情进展。然而，至今没有研究显示SFN是否可以通过上调肾脏MT表达改善DN，也没有研究显示MT是否为Nrf2的下游抗氧化因子。为探讨SFN是否能够增加肾脏MT的表达，我们采用高脂饮食联合链脲佐菌素腹腔注射的方法在C57BL/6J野生型小鼠中建立2型糖尿病(T2DM)小鼠模型，在糖尿病模型建立的同时给予SFN干预4个月，即小鼠被分为对照组、SFN干预组、糖尿病组(DM)、糖尿病+SFN干预组(DM/SFN)。4个月后，处死小鼠并收集血液、尿液及肾脏组织。实验结果显示，与对照组小鼠相比，DM小鼠尿白蛋白/肌酐(UACR)显著增加，肾脏病理改变、炎症、纤维化和氧化损伤均增加，并伴随着肾脏组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)和HDAC4表达增加。SFN干预4个月显著改善了上述病变、降低了HDAC2和HDAC4的表达，这些过程伴随着Nrf2和MT的上调。机制上，SFN抑制HDAC2和HDAC4的表达，导致MT1基因启动子区组蛋白高度乙酰化。另外，SFN显著上调转录因子Nrf2，并增加MT1基因启动子区Nrf2的结合而促进MT1的转录。为探讨SFN对DN的保护作用是否绝对依赖于Nrf2，并进一步证实MT为Nrf2的下游抗氧化因子，我们分别用C57BL/6J野生型小鼠和C57BL/6J Nrf2敲除小鼠诱导T2DM小鼠模型，并于糖尿病模型建立成功的同时给予SFN干预，持续4个月，即C57BL/6J野生型小鼠和C57BL/6J Nrf2敲除小鼠分别被分为对照组、SFN干预组、糖尿病组(DM)、糖尿病+SFN干预组(DM/SFN)。实验结果显示，在野生型小鼠中，SFN显著降低糖尿病小鼠的UACR、肾脏炎症、纤维化，这个过程伴随Nrf2和MT的上调。在Nrf2敲除小鼠中，SFN对DN无任何保护作用，且SFN不能上调MT的表达。为探讨MT是否在SFN的肾脏保护作用中起作用，我们分别用129S1野生型小鼠和129S1MT敲除小鼠诱导T2DM小鼠模型，并于糖尿病模型建立成功的同时给予SFN干预，持续4个月，即129S1野生型小鼠和129S1MT敲除小鼠分别被分为对照组、SFN干预组、糖尿病组(DM)、糖尿病+SFN干预组(DM/SFN)。实验结果显示，在野生型小鼠中，SFN显著降低糖尿病小鼠的UACR，约降低了55%；在MT敲除小鼠中，SFN部分降低了糖尿病小鼠的UACR，约降低了27%，这两个降低百分比之间存在显著性差异。另外，为明确MT是否影响Nrf2的表达，我们检测了129S1野生型小鼠和129S1MT敲除小鼠肾脏Nrf2的表达。结果显示，无论在野生型小鼠亦或MT敲除小鼠中，糖尿病均显著降低了肾脏Nrf2的表达，SFN干预显著增加了Nrf2的表达（包括mRNA水平和蛋白水平）。以上结果表明，SFN可以预防T2DM所致的肾脏损伤，其肾脏保护作用完全依赖Nrf2，部分依赖于MT。MT作为Nrf2的下游因子之一，在SFN保护DN的过程中起重要作用。SFN保护DN的可能机制为：SFN抑制肾脏HDAC2和HDAC4的表达，导致MT1基因启动子区组蛋白高度乙酰化，染色质结构打开，有利于转录因子的结合而易化转录。另外，SFN显著上调转录因子Nrf2，并增加MT1基因启动子区Nrf2的结合而促进MT1的转录，降低糖尿病导致的肾脏氧化损伤，改善DN。本研究主要创新点：（1）本研究应用T2DM小鼠模型，首次探讨了SFN作为HDAC抑制剂和Nrf2激动剂通过上调MT保护DN的机制。（2）以前的研究显示Nrf2和MT呈同向性变化，即在某些条件下同时被上调或下调，而我们的研究首次用染色质免疫共沉淀(ChIP)的方法和Nrf2敲除小鼠、MT敲除小鼠证明了MT是Nrf2的下游抗氧化因子。（3）本研究首次比较了SFN在129S1野生型DN小鼠和129S1MT敲除DN小鼠中的作用，证明了MT在SFN保护DN过程中的重要作用。（4）本研究首次探讨了HDAC抑制剂通过表观遗传学机制上调MT从而保护DN的机制。