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类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性自身免疫疾病。其异常增殖的关节滑膜成纤维样细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLSs)可分泌多种炎性因子参与关节炎症反应。1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-phosphate,S1P),作为一种重要的炎性因子,可与1-磷酸鞘氨醇受体(S1P receptors,S1PRs)结合,通过偶联G蛋白介导下游信号通路参与炎症反应。其中S1PR1/2/3广泛表达于各类细胞中,在细胞增殖、血管新生、内皮屏障功能等方面发挥重要作用。而S1P能够刺激Gαi/Gαs介导的相关下游信号通路,影响环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的表达水平,对炎症起到重要调控作用。但S1P/S1PR1/2/3是否通过介导Gαi/Gαs转换,干预FLSs生物学功能尚未有报道研究。栀子苷(Geniposide,GE)作为抗炎候选药物具有良好的开发前景。课题组前期研究发现,GE通过抑制S1P/S1PR1及其介导的下游信号通路,恢复促/抑炎因子的动态平衡,抑制FLSs异常增殖和血管翳生成,发挥治疗RA的作用。基于前期良好的实验基础以及S1P/S1PRs的研究现状。本研究拟建立S1P诱导的体外RA患者滑膜细胞MH7A炎症损伤模型,探讨GE是否通过抑制S1PR1/2/3,调节偶联的Gαi/Gαs表达水平,恢复Gαi/Gαs的动态平衡,从而抑制FLSs异常增殖。为揭示S1PRs偶联Gα蛋白参与RA关节炎症过程及GE作用机理提供重要依据,也为治疗RA的中药有效成分药物的筛选提供新思路。目的:阐明S1P-S1PR1/2/3-Gαi/Gαs信号通路对MH7A生物学功能的影响,揭示S1PR1/2/3调节Gαi/Gαs转换发生的机制,进一步探讨GE介导S1P/S1PR1/2/3调节Gαi/Gαs转换对MH7A生物学功能的影响。方法:体外培养MH7A,建立S1P诱导的MH7A炎症损伤模型。为阐明S1P通过S1PR1/2/3调节Gαi/Gαs的转换机制,探讨选择性抑制S1PR1、S1PR2、S1PR3、Gαi、激活Gαs等工具药对MH7A生物学功能的影响。为进一步探讨GE对MH7A生物学功能的影响及其介导S1PR1/2/3调节Gαi/Gαs转换发生机制,观察GE(25、50、100μmol/L)干预,选择性抑制S1PR1/3、S1PR2、Gαi、激活Gαs表达对MH7A生物学功能的影响。采用CCK-8、划痕实验、Transwell和流式细胞术等方法检测各组MH7A增殖活性、迁移和侵袭能力、凋亡水平。ELISA法检测MH7A中PGE2、IL-1β、IL-6、IL-8、TGF-β1、c AMP分泌水平。免疫荧光法检测S1PR1/2/3、Gαi/Gαs蛋白在MH7A中定位和偶联情况。RT-q PCR和Western blot法检测MH7A中S1PR1/2/3偶联Gαi/Gαs转换及其下游信号通路中关键基因和蛋白的表达水平。结果:1 S1P诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞MH7A体外炎症损伤模型的建立S1P(0.1-10μmol/L)可在12、24、48 h促进MH7A增殖,S1P刺激后MH7A中c AMP分泌水平和c AMP m RNA水平也明显下调,其中5μmol/L作用24 h更为显著。免疫荧光和Western blot法结果显示S1P(5μmol/L)刺激MH7A后,显著上调S1PR1/2/3蛋白表达水平。因此,S1P(5μmol/L)作用24 h作为后续实验最适造模条件。2 S1P通过S1PR1/2/3偶联Gαi/Gαs转换对MH7A生物学功能的影响用S1PR1抑制剂(W146)、S1PR2抑制剂(JTE-013)、S1PR3抑制剂(CAY10444),Gαi抑制剂(PTX)和Gαs激活剂(CTX)等工具药物,干预S1P诱导的MH7A中S1PR1/2/3、Gαi/Gαs的表达,发现除抑制S1PR2仅抑制MH7A侵袭能力外,其他各组均显著抑制MH7A增殖、迁移和侵袭能力,并促进其凋亡。各组MH7A中IL-1β、PGE2胞外分泌水平均显著降低,而胞内c AMP含量和c AMP m RNA水平明显上升。除了抑制S1PR2后,MH7A中Gαs蛋白不上调外,其他各组用药均下调MH7A中Gαi蛋白表达水平,上调Gαs蛋白表达水平。而S1PR1/3作用相似,后期实验将放在一起研究。3栀子苷介导S1PR1/2/3偶联Gαi/Gαs转换对MH7A生物学功能的影响用GE(25、50、100μmol/L),选择性S1PR1/3双抑制剂(VPC 23019)、S1PR2抑制剂(JTE-013),Gαi抑制剂(PTX)和Gαs激活剂(CTX)等药物,干预S1P诱导的MH7A。结果显示,GE可通过抑制S1PR1/3、Gαi,激活Gαs基因和蛋白表达水平,偶联介导Gαi/Gαs转换,恢复Gαi/Gαs的动态平衡,调节下游信号通路,下调p-Erk1/2、增殖标志蛋白Ki67和抑凋亡蛋白Bcl-2表达水平,上调促凋亡蛋白caspase-3、Bax表达水平,抑制促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8和炎症介质PGE2分泌水平,上调抑炎因子TGF-β1和c AMP分泌水平,恢复促/抑炎因子平衡,进而抑制S1P诱导的MH7A增殖、迁移和侵袭,促进凋亡。此外,GE也可抑制MH7A中S1PR2-Gαi信号通路激活,抑制S1PR2激活介导的相关炎症反应。结论:S1P通过激活MH7A中S1PR1/3,上调Gαi蛋白表达水平,下调Gαs蛋白表达水平,导致Gαi/Gαs失衡,破坏促/抑炎因子的动态平衡,促进MH7A异常增殖。GE主要通过抑制S1PR1/3,介导Gαi-Gαs转换,恢复Gαi/Gαs的动态平衡,调节下游信号通路,下调促增殖蛋白、抑凋亡蛋白表达水平,上调促凋亡蛋白表达水平,恢复促/抑炎因子的平衡,抑制MH7A异常增殖,从而发挥抗炎免疫调节作用。