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一、目的胚胎植入是妊娠成功与否的关键环节。在胚胎植入过程中,子宫内膜在多种妊娠相关因子作用下发生蜕膜化,该过程对胚胎植入、妊娠的建立和维持至关重要。子宫内膜蜕膜化的表现主要包括:子宫内膜腺体增加、螺旋动脉重铸、免疫细胞募集以及细胞外基质成分的改变。另一个极为重要的特征性变化是子宫内膜基质细胞转变为蜕膜细胞,其发生标志是蜕膜标志物泌乳素(prolactin,PRL)和胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGFBP-1)分泌增加。基质细胞蜕膜后可执行容纳胚胎等生物学功能。蛋白质糖基化是蛋白质重要的翻译后加工和修饰方式,在多种生理和病理过程中发挥重要作用,包括胚胎植入、细胞黏附、恶性转化、炎症发生和信号转导等。蛋白质岩藻糖基化是蛋白质糖基化修饰的一种重要形式,岩藻糖基转移酶Ⅶ(Fucosyltransferase 7,FUT7)属于N-岩藻糖基转移酶,FUT7通过α1-3糖苷键特异性催化合成唾液酸路易斯寡糖抗原-X(sialyl Lewis X,sLe~X)。糖基化异常的蛋白质分子,其生物学特性和功能发生改变。实验室前期研究发现,FUT7在胚胎植入过程中发挥重要作用,如促进胚胎与子宫内膜上皮细胞的黏附,但其在子宫内膜蜕膜化过程中发挥的作用及其机制尚不清楚。故本文旨在探究FUT7在子宫内膜蜕膜化过程中的作用基质,为了解女性流产的原因提供一定的理论基础。二、方法1、免疫组织化学、蛋白质免疫印迹法(Western blot)和实时定量基因扩增荧光检测(Real-time PCR)方法,检测人增生期、分泌期、早孕期子宫内膜以及难免流产患者的子宫内膜组织中FUT7和sLe~X表达。2、体外诱导子宫内膜基质细胞(human endometrial stromal cells,HESCs)蜕膜化,诱导方法为甲羟孕酮17-乙酸酯(Medroxyprogesterone 17-acetate,MPA)和双丁酰环磷酸腺苷(dibutyryl c AMP,dbc AMP)联合作用72h。利用Western blot、Real-time PCR和细胞免疫荧光方法检测细胞蜕膜化前后FUT7表达的变化。3、上调或下调改变FUT7的表达,利用Western blot、Real-time PCR和细胞免疫荧光方法检测蜕膜标志物PRL、IGFBP-1以及sLe~X的表达的变化。4、上调或下调改变FUT7表达,利用CCK8、平板克隆、Western blot和Real-time PCR方法检测蜕膜细胞的增殖能力。5、滋养层细胞(HTR)刺激子宫内膜基质细胞模拟胚胎植入时子宫内膜的改变,检测ERK1/2信号通路的激活情况。利用Western blot和Real-time PCR方法,检测蜕膜化后上调或下调FUT7的表达对ERK1/2信号通路的影响。6、免疫组织化学方法分析妊娠不同天数小鼠子宫内膜中FUT7、sLe~X和PRL的表达情况。取妊娠第3天的小鼠,在其一侧宫角注射FUT7-si RNA,另一侧注射生理盐水作为对照,在妊娠第8天时取出小鼠子宫,免疫组织化学实验分析不同处理组小鼠子宫内膜中FUT7、sLe~X、PRL、IGFBP-1、PCNA的表达以及ERK1/2信号通路的激活情况。三、结果1、免疫组织化学结果显示FUT7及sLe~X在增生期、分泌期、早孕期的人子宫内膜组织呈上升趋势,在难免流产患者子宫内膜组织中表达显著下降。2、体外诱导人子宫内膜基质细胞蜕膜化。通过Western blot、Real-time PCR和细胞免疫荧光方法证实蜕膜标志物PRL和IGFBP-1的表达明显升高,表明体外诱导蜕膜成功,在蜕膜化后FUT7表达显著升高。3、Western blot、Real-time PCR和细胞免疫荧光的结果表明HESCs蜕膜化诱导的同时,上调FUT7的表达,可以增加蜕膜标志物PRL和IGFBP-1的表达。下调FUT7的表达,可以抑制其表达。4、通过平板克隆和CCK8实验结果显示诱导HESCs蜕膜后上调FUT7的表达,子宫内膜细胞的增殖能力明显增加,下调FUT7的表达,子宫内膜细胞的增殖能力下降。通过Western blot和Real-time PCR实验,结果发现表明上调FUT7的表达时,细胞增殖核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白(cyclin D、cyclin E、CDK4、CDK6)的表达水平增加,增殖抑制蛋白(p21、p27)表达水平下降。下调FUT7表达,以上指标亦发生相应改变。说明FUT7通过激活细胞周期蛋白促进蜕膜细胞的增殖能力。5、实验结果显示在HTR细胞刺激下,p-ERK1/2信号通路被激活。诱导HESCs蜕膜化后上调FUT7的表达,p-ERK1/2信号通路被激活,下调FUT7的表达,p-ERK1/2信号通路的激活受到抑制。6、免疫组织化学结果显示PRL、FUT7和sLe~X的表达在妊娠第4,5,6天小鼠的子宫内膜呈上升趋势。小鼠子宫宫角注射FUT7-si RNA后子宫内膜蜕膜化受到抑制,胚胎着床率降低。免疫组织化学分析显示FUT7下调可以抑制蜕膜化的发生、抑制细胞的增殖能力以及抑制ERK1/2信号通路的激活情况。四、结论1、FUT7及sLe~X在妊娠早期妇女子宫内膜蜕膜组织中升高,而难免流产患者子宫内膜蜕膜组织中表达降低。2、FUT7促进sLe~X的合成并促进基质细胞蜕膜化。3、下调FUT7表达水平阻碍小鼠子宫蜕膜化过程,抑制胚胎着床。