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目的:儿童过敏性紫癜性肾炎是危害儿童健康的自身免疫性疾病,临床上缺乏特效治疗药物。西医治疗以激素为主,因疗程较长,给儿童的成长带来很多副作用。中医临床多使用中药复方,标本兼治,有良好开发前景。我校附属医院名老中医张君教授,临床研究三十余年创立了治疗儿童过敏性紫癜性肾炎的复方“芪蓟肾康”,并制成颗粒剂,临床愈显率达78.5%。但该方药味较多,临床上给药量大,儿童服用困难,急需优化,精减药味,利于儿童用药。本文基于化学成分是临床处方的功效物质基础,依据“只有存在于制剂且有一定浓度的化学成分才可能是处方有效成分”的原则,通过复方制剂的化学成分的鉴定,逆向寻找复方的主要药味,由此对处方进行药味精减,并结合临床专家用药经验,形成新组方。为验证新组方的合理性和有效性,将新组方与原方平行进行药效学研究,依据相关指标进行疗效评价,为临床有效复方优化提供了新的方法。方法:1.处方优化:查阅CNKI、Pubmed、Science finder、dictionary of natural products等数据库,汇总芪蓟肾康处方中所有单味药的化学成分,使用Waters质谱的Unify数据库格式,建立“芪蓟肾康”成分信息数据库。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术,在正负离子模式下,进行芪蓟肾康颗粒剂的MS及MS/MS谱测试,将测试数据导入自建数据库以及Waters公司提供的Unify数据库,进行芪蓟肾康颗粒的化学成分鉴定。将准分子离子与碎片离子相结合,进行结构鉴定,总结不同类型成分的质谱裂解规律及特征碎片离子,汇总芪蓟肾康颗粒中化学成分的类型,并归属其成分的单味药来源,对于没有在制剂中检测到或极少检测到其成分的单味药进行精减,据此对处方进行优化。2.依据过敏性紫癜性肾炎与Ig A肾病的病机相同,均表现为Ig A蛋白沉淀于肾小球,肾小球系膜细胞增殖,肾小球纤维化,肾脏血液呈高凝状态等,以Ig A肾病为动物模型进行药效评价研究。用口服牛血清白蛋白(BSA),剂量为600 mg/kg,隔日灌胃,持续8周,皮下注射蓖麻油0.50 m L+CCl4 0.10 m L,每周一次,持续9周,联合应用脂多糖LPS(分别于第6、8周以0.25 mg/只)尾静脉注射的方法制备SD大鼠Ig A肾病模型。参考临床肾脏损伤的标准,以血尿、蛋白尿、肌酐、尿素氮的含量及肾脏组织切片为指标,从整体上考察芪蓟肾康组方优化前后对模型大鼠肾脏损伤的影响。同时,采用肾脏损伤的效应细胞——肾小球系膜细胞与血管内皮细胞,进行细胞实验。以血管紧张素II(Ang II)制备肾小球系膜细胞增殖模型,以过氧化氢(H2O2)制备血管内皮细胞损伤模型,采用MTT、ELISA、Western blot等技术,从抑制细胞因子IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1、NF-κB、PAI-1释放,以及相关蛋白表达等角度,揭示芪蓟肾康的作用机制,比较组方优化前后的药效作用差异,评价处方优化的合理性。结果:1.首次系统地揭示了芪蓟肾康颗粒的药效物质基础,从芪蓟肾康颗粒中共鉴定出黄酮、三萜、环烯醚萜、蒎烷单萜、苯丙素、没食子苷、苯甲酸苷及其他类共8类282个成分,包括118个单体成分,以及164个同分异构体。依据这些成分在处方中单味药的来源,提示原处方中的黄芪、小蓟、丹参、牡丹皮等7味药为主要药味,根据医生的临床经验调整处方剂量比例,并增加了海风藤,由此获得优化后新处方,单次服药量较原方减少了40%,易于制成单次剂量为5 g的颗粒剂,能保证儿童用药的要求。2.整体动物实验结果显示:与模型组比较,芪蓟肾康组方优化前后均能显著降低大鼠的尿中红细胞计数以及尿蛋白含量(P<0.05),均有降低Ig A肾病大鼠血清循环免疫复合物的作用(P<0.05),且均能降低大鼠血清中尿素氮和肌酐的含量(P<0.05),但二者无显著差异。光镜下,空白组大鼠肾小球体积正常,系膜区无明显增生,系膜基质未见增加,毛细血管袢开放良好;模型组大鼠肾小球体积增大,系膜区明显增宽,肾小球系膜细胞和系膜基质中度或重度增生,少见新月体形成和明显硬化性损害;部分肾小管上皮浊肿、灶状上皮细胞脱落,肾间质淋巴细胞浸润、纤维化。芪蓟肾康组方优化前后各组大鼠的肾小球体积轻度增大,系膜区增宽不明显,肾小球系膜细胞和系膜基质以轻度增生为主,无新月体形成和硬化性;少数有肾小管上皮浊肿,肾间质有少数淋巴细胞浸润及纤维化。肾小球系膜细胞(HBZU-1)实验表明,10-5～10-6 mol/L浓度的AngⅡ作用于HBZU-1后,造模组细胞显著增殖(P<0.05)。与造模组比较,芪蓟肾康组方优化前后均能显著抑制肾小球系膜细胞增殖,能降低肾小球系膜细胞释放IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1、NF-κB,并可抑制NF-κB的蛋白表达及其亚单位P65(Ser 276)位点磷酸化(P<0.05),但二者无显著差异(P>0.05)。血管内皮细胞实验表明,1×10-7 mol/L浓度的H2O2可造成内皮细胞受损,细胞数量明显降低显(P<0.01)。与模型组相比,芪蓟肾康组方优化前后均能显著保护血管内皮细胞受损,有降低PAI-1释放的作用(P<0.05),但二者无显著差异(P>0.05)。结论:(1)依据LC-MS法反向追踪复方制剂的成分,可以快速鉴定复方的化学成分,并可以利用复方中化学成分有效地逆向追踪中有效药味。(2)依据整体动物实验和细胞实验,提示芪蓟肾康新方可以抑制过敏性紫癜性肾炎模型动物的肾脏损伤,可抑制肾小球系膜细胞增殖及其炎性因子释放,并可保护血管内皮细胞,从而抑制肾小球硬化,调节过敏性紫癜性肾炎的凝血机制紊乱,实现其活血化瘀、凉血解毒的功效。优化后新方与原方药效作用相近,提示基于LC-MS指导的复方精减,结合临床经验,进行组方优化的思路和方法可行。