厚皮海绵化学成分与双齿围沙蚕糖苷酶的研究

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海绵作为滤食性海洋生物,它能够产生许多具有新颖结构的化学成分,这些化学成分往往具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、降压等生物活性。但对于澳大利亚厚皮海绵( Craniella australiensis)化学成分的研究报道较少。双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)中也含有大量的生物活性物质,尤其是糖苷酶类活性物质。本文针对这2种海洋生物的生物活性物质进行了研究,以期为海洋生物的利用提供基础数据。  本研究主要内容包括:⑴澳大利亚厚皮海绵经75%乙醇热提取后,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到浸膏。利用一系列色谱技术和重结晶等方法分别对乙酸乙酯和正丁醇萃取浸膏进行分离提取纯,得到3个化合物。通过理化常数测定及NMR数据分析,确定了2个化合物的结构,分别为Aldisin和2-Bromoaldisin。这2个化合物均是首次从该属中分离得到。⑵澳大利亚厚皮海绵各层浸膏抑制ACE酶活性实验表明,各层浸膏均具有抑制ACE酶活性,抑制作用均有具有剂量依赖性,且乙酸乙酯层浸膏抑制作用最强,其IC50为2.61mg/mL。⑶采用CCK-8法对澳大利亚厚皮海绵总浸膏进行体外抗肿瘤实验结果表明,总浸膏浓度为200mg/mL时,对人胃癌细胞AGS、人肝癌细胞HepG2、人卵巢癌细胞SKOV3均具有抑制活性。采用CCK-8法对得到的 Aldisin和2-Bromoaldisin进行体外抗肿瘤实验,结果表明Aldisin和2-Bromoaldisin对人克隆结肠腺癌细胞Caco-2、人结肠癌细胞HCT116、人肝癌细胞7721、人胶质瘤细胞U251以及人肾癌细胞A498都具有抑制活性。其中Aldisin对7721细胞抑制作用最强,IC50为67.56±3.06μg/mL。这2种化合物可作为潜在的抗肿瘤药物进行进一步的研究。⑷通过80%饱和度(NH4)2SO4从双齿围沙蚕中提取得到粗蛋白,粗蛋白依次经过DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析进行提纯分离。对所得到的蛋白进行进行糖苷酶活性检测,发现其具有β-葡萄糖苷酶活性、β-半乳糖苷酶活性以及α-甘露糖苷酶活性,酶提取回收率分别为39.5%、20.3%、1.9%。双齿围沙蚕β-葡萄糖苷酶最适温度为50℃,最适pH为7,Km为8.14×10-5 M,Vmax为3.19×10-4 M/h。双齿围沙蚕β-半乳糖苷酶最适温度为50℃,最适pH为6,Km为1.20×10-4 M,Vmax为1.63×10-4 M/h。双齿围沙蚕α-甘露糖苷酶最适温度为70℃,最适pH为4,Km为6.17×10-5 M,Vmax为1.82×10-5 M/h。金属离子对糖苷酶有不同程度的抑制作用,尤其 Ag+作用最强。双齿围沙蚕糖苷酶的研究为双齿围沙蚕的利用及糖苷酶药物开发利用提供了基础数据。
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