第一章LOX-1与肥胖相关性研究摘要[研究背景]肥胖是一种常见代谢疾病,源于体内能量的代谢失衡所导致的体脂过度积聚。肥胖可引起多种代谢疾病的发生,如糖尿病、心血管疾病、脂肪肝、激素紊乱和某些类型的肿瘤等。肥胖本身是一种慢性炎性状态,伴随血浆中炎症因子水平升高,如肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)和C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)。植物凝集素样氧化性低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein recepter-1,LOX-1)是存在于血管内皮细胞表面的ox-LDL特异性受体,是血管内皮细胞摄取和代谢ox-LDL的主要受体。LOX-1是一种多配体受体,配体包括ox-LDL、高级糖基化终产物、激活的血小板、中性粒细胞、凋亡/老化细胞、CRP和细菌等。LOX-1表达在高度血管化的组织,如胎盘和肺,也表达在肾组织和脂肪组织。LOX-1在多种心血管疾病(包括动脉粥样硬化和高血压心血管重构)的发生与发展中起重要作用。LOX-1通过氧化应激和促炎机制介导心脏、胸主动脉和肾血管重构、肾脏炎症和纤维化等病理过程。最近研究发现LOX-1与肥胖也具有相关性。肥胖女性患者血浆中可溶性LOX-1的水平明显升高。肥胖小鼠脂肪组织中LOX-1的表达显著高于对照组,且LOX-1在脂肪组织中的表达与促炎性细胞因子MCP-1、IL-6和巨噬细胞炎性蛋白-1α水平显著相关。但是LOX-1在肥胖病理过程中的作用和机制并不清楚。因此,本研究拟在肥胖小鼠模型确证LOX-1与肥胖的相关性,并进一步探讨LOX-1是否与内脏脂肪组织的炎性改变、坏死和脂肪生成增加相关。[方法](1)肥胖模型的构建： C57BL/6J小鼠(15-17g)高脂饲料诱导16周。(2)肥胖模型的评价：测定小鼠的体重、体长、Lee’s指数和BMI,以及血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和自由脂肪酸(FFA)水平。(3)HE染色观察内脏脂肪组织细胞形态。(4)LOX-1的检测：real-time PCR检测内脏脂肪组织LOX-1mRNA水平,免疫组化染色检测其蛋白表达。(5)炎性细胞因子的检测：real-time PCR检测内脏脂肪组织TNF-α、IL-6和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)mRN水平。(6)脂肪生成关键因子的检测：real-time PCR检测CCAAT增强子结合蛋白p(C/EBPβ)、过氧化物酶体增殖激活受体-γ(PPARy)和脂肪细胞脂肪酸结合蛋白-2(aP-2)mRNA水平。(7)凋亡和坏死相关基因的检测：real-time PCR检测胸苷激酶(TK)和受体相互作用蛋白激酶-1(RIPK1)的mRNA水平。[结果]1.高脂饮食诱导小鼠的体重、Lee’s指数和BMI显著增加;2.高脂饮食增加小鼠血清中TG、TC、LDL和FFA水平；3.高脂饮食增加小鼠内脏脂肪细胞体积,诱导细胞死亡及炎症细胞浸润；4.肥胖小鼠内脏脂肪组织LOX-1mRNA和蛋白表达增加；5.肥胖小鼠内脏脂肪组织炎性细胞因子mRNA水平增加；6.肥胖小鼠内脏脂肪组织脂肪生成关键调控因子mRNA上调；7.肥胖小鼠内脏脂肪组织坏死调控基因RIPK1的mRNA水平上调。[结论]LOX-1的表达与肥胖相关,且可能调控内脏脂肪组织炎性改变、坏死和脂肪生成。第二章LOX-1在棕榈酸诱导3T3-L1小鼠前脂肪细胞凋亡和坏死中的作用及机制摘要[研究背景]肥胖不仅是脂肪组织脂肪细胞的增殖和肥大,也伴随着脂肪细胞和前脂肪细胞的凋亡和坏死。脂肪细胞的死亡在肥胖小鼠可增加30倍,在肥胖患者也增加显著,并且呈现“坏死”的超微结构。脂肪组织15%-50%的细胞是成纤维细胞样前脂肪细胞,它们具有接收胞外信号刺激分化为脂肪细胞的能力,并且在脂肪组织有抵抗脂毒性作用。研究发现肥胖妇女体内前脂肪细胞数量(17%)明显低于体重正常组(30%)。更为重要的是,分离肥胖妇女脂肪组织中的前脂肪细胞,与对照组相比,发现这种前脂肪细胞的分化能力降低、对凋亡刺激的敏感性增加。同时,在原代细胞培养中也发现前脂肪细胞对死亡刺激的敏感性增加。前脂肪细胞的凋亡对肥胖具有重要意义,主要诱导脂肪组织的重构。研究发现,肥胖患者体内前脂肪细胞发生凋亡后,其数量的降低和分化潜能的下降会导致脂肪组织内成熟的脂肪细胞异常肥大和功能异常,进而导致低级别炎症和胰岛素抵抗的发生。LOX-1的一个重要功能就是调控程序性细胞死亡和凋亡。LOX-1可以通过激活Bax/Bcl-2通路增加Bax/Bcl-2比值,或通过激活促凋亡因子Caspase-3/Caspase-9诱导血管平滑肌细胞的凋亡。LOX-1也可影响机体的氧化应激反应,可通过增加ROS产生来诱导氧化应激。LOX-1是否介导棕榈酸引起的前脂肪细胞凋亡?未见报道。因此,本章研究LOX-1在棕榈酸诱导3T3-L1小鼠前脂肪细胞凋亡和坏死中的作用及机制。[方法](1)不同浓度棕榈酸处理3T3-L1小鼠前脂肪细胞12、24和48h,检测其对细胞活力(MTS法)、增殖水平(BrdU法)和细胞死亡(Hoechst33258、 Annexin V-PI双染)的影响,并采用real-timePCR检测TK和RIPK1mRNA表达,Western-blot检测Bax/Bcl-2和细胞色素C蛋白表达；(2)棕榈酸处理细胞不同时间,检测LOX-1mRNA表达水平；(3)LOX-1抑制分析：中和抗体实验：采用LOX-1中和抗体(10ng/m1)预孵育1h,棕榈酸处理后流式细胞术检测细胞凋亡和坏死,]-eal-time PCR或Western Blot检测TK、RIPK1、Bax/Bcl-2和细胞色素CmRNA或蛋白表达,荧光酶标仪检测ROS生成；LOX-1siRNA实验：采用Scientic DharmaFECTsiRNA转染试剂将LOX-1siRNA干扰片段瞬时转入细胞,棕榈酸处理,同中和抗体实验检测细胞凋亡、基因表达和ROS生成。(4)应用3种不同抗氧剂检测细胞活力和TK、RIPK1mRNA表达判断ROS来源。[结果]1.棕榈酸可时间依赖性和浓度依赖性地诱导3T3-L1小鼠前脂肪细胞凋亡和坏死。2.棕榈酸可下调TK mRNA,上调RIPK1mRNA,增加Bax蛋白表达,降低Bcl-2蛋白表达和增加细胞色素C蛋白表达。3.棕榈酸处理6h即可增加LOX-1mRNA表达。4. LOX-1抑制后显著抑制细胞凋亡和坏死,逆转TK和RIPK1mRNA表达,逆转Bax、Bcl-2和细胞色素C蛋白表达,抑制棕榈酸诱导ROS产生。4.应用抗氧剂Tempo1、DPI和MnTBAP后,仅线粒体氧化应激抑制剂MnTBAP保护棕榈酸诱导的细胞死亡。[结论]LOX-1介导棕榈酸诱导3T3-L1前脂肪细胞的凋亡和坏死,其机制可能涉及线粒体活性氧的产生。第三章LOX-1在棕榈酸诱导3T3-L1小鼠前脂肪细胞炎症中的作用及机制摘要[研究背景]肥胖不仅会增加胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生,此外可增加其它慢性疾病的风险,比如心血管疾病、高胆固醇血症、高脂血症、关节炎、哮喘和肿瘤。肥胖本身就可引起代谢组织的炎症状态,其特点主要是：(1)通常由代谢因素引起,而且是代谢细胞特异性的；(2)通常代谢组织伴随免疫细胞的浸润；(3)另一个特点是慢性。炎症细胞因子的表达、免疫细胞的浸润都是逐步发生的,而且持续一定的时间,炎症反应不容易消除。肥胖可引起多种代谢综合征的发生和发展,而炎症在这个过程中扮演着重要的角色。脂肪组织作为炎症启动和发生的主要场所,其分泌的炎症细胞因子可直接引发脂肪细胞的胰岛素抵抗。脂肪组织的炎症不仅影响脂肪组织,也可以通过细胞因子的释放进入循环系统,而影响其他组织脏器的功能,如肝脏、肌肉组织、胰脏等。肥胖、高血脂和糖尿病等代谢紊乱性疾病通常都伴随着血清脂肪酸浓度的增加。过量的脂肪酸对机体的影响主要体现为体重的增加和炎症,其中饱和脂肪酸对炎症的影响尤为突出。LOX-1在高脂饮食诱导的肥胖小鼠中表达显著增加,与炎症细胞因子MCP-1和IL-6的表达显著相关,同时LOX-1基因敲除小鼠MCP-1和IL-6的表达显著降低,提示LOX-1在肥胖炎症中可能发挥重要作用。LOX-1也介导炎症信号通路,其可以通过激活PKC-MAPK途径,进一步激活NF-κB,也可以激活AP-1,从而引起炎症基因的表达。AMPK在不同的组织和细胞发挥重要抗炎作用,包括在脂肪细胞、内皮细胞和巨噬细胞。肥胖伴胰岛素抵抗患者内脏脂肪组织中AMPK活性是降低的,而且与多个炎症细胞因子的表达增加有关。巨噬细胞沉默AMPK后明显增加NF-κB信号和炎性标志物的表达。因此,我们猜测LOX-1是否也介导了棕榈酸诱导的前脂肪细胞炎症反应,而且是否通过激活蛋白磷酸酶PP2A抑制AMPK,从而增加NF-κB信号和炎性标志物的表达。[方法]1.棕榈酸对3T3-L1小鼠前脂肪细胞炎症细胞因子TNF-α、IL-6和MCP-1的mRNA表达和分泌水平的量效和时效关系实验；2.棕榈酸处理细胞后,检测LOX-1表达；3.LOX-1抑制分析：LOX-1中和抗体或siRNA转染细胞后,检测棕榈酸诱导炎症细胞因子mRNA表达和分泌、AMPK磷酸化和PP2A蛋白表达,以及NF-κBp65核转运和细胞内水平的影响；4.AMPK激活或抑制分析：应用AMPK激动剂AICAR或抑制剂Compound C,观察棕榈酸诱导炎症细胞因子mRNA表达和分泌、NF-κB p65核转运和细胞内水平,以及对LOX-1表达的影响。[结果]1.棕榈酸呈浓度依赖性地增加炎症细胞因子TNF-α、IL-6和MCP-1mRNA表达和分泌,炎症因子不同其表达时间不同,在比较早期诱导TNF-a表达；2.棕榈酸处理细胞后,显著增加LOX-1表达；3.LOX-1抑制后显著降低炎症因子表达,但对AMPK磷酸化和PP2A表达无影响；可抑制棕榈酸诱导的NF-κB p65核转运和细胞内水平；4.AMPK激活后显著降低炎症因子表达、抑制棕榈酸诱导的NF-κB p65核转运和细胞内水平、抑制LOX-1表达,AMPK抑制后则相反。[结论]LOX-1通过调控NF-κB介导棕榈酸诱导前脂肪细胞炎症反应。棕榈酸诱导的AMPK磷酸化可能是一种代偿性保护机制,可能通过抑制LOX-1-NF-κB炎症通路而代偿性减轻棕榈酸诱导的前脂肪细胞炎症反应。第四章LOX-1在棕榈酸诱导脂肪生成中的作用及机制摘要[研究背景]肥胖是由于脂肪细胞体积过度肥大以及数目增多所引起。而脂肪细胞体积肥大,主要是由于脂肪细胞内脂肪生成增加所引起。脂肪生成是成纤维细胞样前脂肪细胞分化为成熟的、充满脂质的、对胰岛素敏感的脂肪细胞的过程。脂肪组织细胞分化历经两个阶段,第一阶段是间质细胞向前脂肪细胞的定向转化,第二阶段是前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞。在胰岛素、糖皮质激素和胞内cAMP的诱导下,前脂肪细胞历经接触抑制阶段、有丝分裂克隆扩增阶段、分化中期和分化末期这4个过程。脂肪生成是一个紧密有序的多级过程,需要连续活化多个转录因子,主要包括C/EBP家族和PPAR-γ。脂肪酸是高脂饮食的主要成分,尤其是饱和脂肪酸,不仅为机体提供能量,而且可以与细胞膜和核膜表面很多受体结合,启动细胞内信号通路,导致肥胖、冠心病、胰岛素抵抗和动脉粥样硬化等疾病的发生。研究发现脂肪酸具有促进脂肪细胞分化的作用。最近研究发现,小鼠LOX-1基因敲除后会下调脂肪生成关键转录因子C/EBP-β和PPAR-γ的表达。因此,我们推测棕榈酸诱导前脂肪细胞分化过程中,LOX-1可以通过C/EBP-β, PPAR-γ途径介导细胞内的脂肪生成。[方法](1)3T3-L1前脂肪细胞诱导分化,并在诱导分化时加入棕榈酸处理,分别于0、2、4、6和8天收集细胞,采用油红O染色和检测细胞内甘油三酯含量变化观察脂肪生成情况,real-time PCR和Western-blot检测分化转录因子C/EBP-β和PPAR-γ mRNA和蛋白表达,关键基因aP-2和Pref-1mRNA表达；(2)real-time PCR和Western-blot检测LOX-1表达；(3)LOX-1抑制分析：采用LOX-1siRNA干扰技术抑制LOX-1表达后,油红O染色和细胞内甘油三酯测定检测LOX-1抑制2、4、6和8天细胞脂肪生成情况；同时检测LOX-1siRNA抑制2和4天后,对分化转录因子C/EBP-β和PPAR-γmlRNA和蛋白表达,关键基因aP-2和Pref-1mRNA表达的影响。[结果](1)棕榈酸显著促进3T3-L1前脂肪细胞脂肪生成,在早期第2天显著增加C/EBP-p表达,持续增加PPAR-γ表达,增加分化末期aP-2mRNA表达,逐渐下调Pref-1mRNA表达；(2)棕榈酸显著增加LOX-1表达；(3)LOX-1siRNA抑制后,显著抑制前脂肪细胞的分化,抑制脂肪生成,并分别抑制分化第2和4天分化转录因子C/EBP-p和PPAR-γ mRNA和蛋白表达,关键基因aP-2mRNA表达,并显著恢复了Pref-1的mRNA表达。[结论]LOX-1通过调控脂肪生成转录因子C/EBP-β、PPAR-γ和关键基因Pref-1和aP-2介导棕榈酸诱导脂肪生成过程。