头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC),是威胁人类健康的主要肿瘤之一,已成为全球第六大好发肿瘤。HNSCC患者的5年生存率不足50%,世界范围内致死率排名第五。恶性增殖和化疗抵抗是HNSCC重要的临床表现。因此,探究HNSCC增殖及化疗抵抗的分子机制,寻找新的有效治疗靶点,将成为改善头颈部鳞癌患者治疗效果的重要突破口。EGFR是一种广泛分布于哺乳动物的细胞表面受体,在细胞的分化、生长和增殖等各个生理过程发挥重要作用。在多种恶性肿瘤的细胞中,EGFR的表达均高于正常细胞。在90%以上的头颈鳞癌中,EGFR表达升高。以此为基础,临床上使用针对EGFR的靶向药物,进行靶向治疗。但当EFGR发生突变时,便会导致临床药物的耐药。现已发现许多EGFR突变型,其中最常见的是EGFRv III型(the type III EGF deletion-mutants receptor)。β-catenin作为Wnt的信号传导途径,是其重要的组成成分,主要参与了基因的表达,和介导细胞的黏附。目前的研究表明,β-catenin基因突变及过表达,与肿瘤的发生、发展和预后密切相关。而作为一种丙酮酸激酶的同工酶,PKM2(Pyruvate kinase isozyme thpe M2)不仅在糖酵解过程中发挥重要功能,还能够影响β-catenin的活性及下游基因的转录。本研究对头颈鳞癌中EGFR wt/v III调控肿瘤细胞生长及化疗抵抗的功能和分子机制进行了以下实验研究。研究共分为三个部分:第一部分:我们分别对5个头颈鳞癌细胞系处理并提取蛋白,采用Western blot的方法检测细胞中EGFR的表达水平,并选取了UM1和SCC25两个细胞系,建立了野生型及v III突变型的两种细胞系,应用克隆形成实验和CCK8细胞增殖实验来检测其细胞的增殖能力;通过流式细胞术及药敏实验,来检测细胞对顺铂的抵抗能力。第二部分:对EGFR野生型细胞进行EGF处理后,应用Western blot及免疫荧光检测PKM2入核的水平。然后对EGFR野生型及突变型细胞同时进行EGF处理,通过Western blot检测PKM2入核情况及β-catenin的活性。通过分析GEO数据库,探究头颈鳞癌中PKM2与β-catenin的表达情况及相关性。第三部分:根据文献报道,R399/400位点对PKM2入核至关重要,因此,我们建立了PKM2高表达及R399/400A突变型稳定克隆,应用Western blot方法检测PKM2入核对β-catenin通路、下游基因表达的影响。通过CCK8增殖实验、克隆形成实验、流式细胞术检测头颈部鳞癌细胞中PKM2入核对细胞增殖及顺铂抵抗的影响。结果:在UM1、SCC25野生型及v III突变型的两种细胞系中,我们发现,无论有无EGF的刺激,v III突变型细胞系的生长、增殖速度更快。v III突变型细胞系的平板克隆形成能力及顺铂抵抗能力也强于野生型细胞系。在UM1、SCC25野生型及v III突变型的细胞系中,应用β-catenin抑制剂FH535进行处理后发现,两种细胞系的增殖均受到了抑制,但EGFR v III突变型的细胞系可抵抗β-catenin抑制剂的抑制效果。这表明,在头颈鳞癌中,EGFR v III突变型细胞系的β-catenin活性更高。因此我们认为,EGFR v III可能通过调控β-catenin通路介导了头颈鳞癌的增殖和顺铂抵抗。通过对HNSCC细胞系的检测和GEO数据库的分析,我们发现在头颈鳞癌中,PKM2和β-catenin均高表达,且二者呈正相关关系。在应用EGF刺激后,EGFR被激活,从而介导PKM2的入核。同时我们发现,相比于野生型细胞系,EGFR v III能够促进PKM2的入核,并增加β-catenin的磷酸化水平,也再一次证明了EGFR v III突变型细胞系的β-catenin活性更高。在R399/400位点突变后,PKM2的入核受到了抑制,导致β-catenin通路活性降低,且β-catenin下游基因CCND1的表达下调。我们发现PKM2高表达后,头颈鳞癌细胞的细胞增殖能力、克隆形成能力及顺铂抵抗能力显著升高,而R399/400位点突变后,上述功能则与对照组无明显差异。结论:1.在头颈鳞癌中,EGFR wt/v III介导细胞的增殖与顺铂抵抗。2.在头颈鳞癌中,EGFR wt/v III型细胞的β-catenin通路活性升高。3.在头颈鳞癌中,PKM2与β-catenin呈正相关关系。EGFR wt/v III可促进PKM2入核,激活β-catenin通路。4.PKM2 R399/400对其入核至关重要,从而影响β-catenin通路活性及下游基因的表达,介导头颈鳞癌细胞的增殖与耐药。