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癌症是导致人类疾病相关死亡的主要原因,化疗是治疗肿瘤的有效手段,但化疗耐药是临床患者被迫终止治疗导致化疗失败的主要原因。目前抗肿瘤药物耐药性研究主要是基于药物靶点、凋亡途径变化、DNA损伤修复等集中在癌细胞本身,但是其临床效果令人失望。肿瘤免疫微环境与肿瘤发展密切相关,但化疗耐药与免疫应答的关系尚未见报道。中性粒细胞是先天免疫最重要的效应因子,在肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用。肿瘤相关中性粒细胞的积聚与预后不良呈正相关,且中性粒细胞具有抗肿瘤的N1表型和促肿瘤的N2表型。黄连素是黄连的异喹啉生物碱,且黄连素能有效的调控中性粒细胞的功能。阿霉素是化疗耐药的代表药物。但黄连素对中性粒细胞表型的影响以及表型改变对阿霉素耐药的影响未见报道。本研究的目的是探讨中性粒细胞表型与化疗耐药的关系以及黄连素调控中性粒细胞改善阿霉素耐药的机制。本研究分为体外、体内、机制三个部分。在体外研究中,通过ATRA诱导HL60使其分化为HL60-N1,使用TGF-β诱导HL60-N1使其分化为HL60-N2,获取两种中性粒细胞表型。使用ELISA试剂盒(IFN-γ,IL-2,IL-6,PD-L1,IL-10,TGF-β)检测两种细胞因子水平;MTT法检测HL60-N1和HL60-N2细胞对肿瘤细胞活力的影响;以不同浓度黄连素和阿霉素处理HL60细胞和HL60-N1,HL60-N2细胞,MTT检测黄连素和阿霉素对细胞活力的影响;激光全息检测阿霉素黄连素对不同分型的中性粒细胞细胞形态的影响;瑞士吉姆萨染色检测其对核形态的影响;Annexin V-FITC/PI检测其对凋亡的影响;噬菌实验检测其对吞噬能力的影响;免疫荧光检测其对CD66b表达的影响。在体内研究中,首先建立乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型,评价黄连素、阿霉素及黄连素阿霉素组合物对肺癌模型小鼠肿瘤生长和肺部肿瘤结节数的影响;HE检测肺部组织病理变化;免疫荧光和伊文思兰染色检测小鼠肺组织血管通透性的变化;免疫荧光染色检测肺癌小鼠肺泡灌洗液中中性粒细胞分型的变化;免疫组化检测小鼠脾脏组织中PD-1的表达;流式检测细胞毒T细胞的比率;血常规检测各组小鼠NLR水平,评价黄连素阿霉素对乌拉坦诱导肺癌的影响。并采用LY6G-m Ab消耗中性粒细胞分析中性粒细胞在肺癌发生中的作用。继而建立H22异种移植瘤小鼠模型,评价异种移植瘤模型小鼠生命体征和肿瘤生长;免疫荧光检测骨髓中性粒细胞CD66b、CD309的表达;伊文思兰检测肿瘤组织通透性;血常规检测各组小鼠NLR水平;流式检测细胞毒T细胞的比率。采用过继性输注HL60-N1和HL-60-N2细胞和LY6G-m Ab消耗中性粒细胞评价中性粒细胞在肿瘤进展阿霉素抵抗中的作用。最后建立免疫再攻击模型,记录肿瘤生长变化、骨髓中性粒细胞CD66b、CD309的表达、肿瘤组织通透性和NLR水平和记忆性T细胞的比率。评价中性粒细胞免疫抑制作用,以及黄连素对中性粒细胞的调节作用。在机制研究中,AO染色和免疫荧光检测LC-3B和P62表达、DCFH-DA、MitoTracker Green、Lyso-Tracker Red分别检测细胞的自噬、ROS、线粒体、溶酶体功能;NBT检测黄连素和阿霉素单独及其组合对HL60细胞分化的影响;CFSE-7AAD染色检测黄连素和阿霉素及其组合对细胞裂解能力的影响;钙黄绿素释放试验评估对细胞免疫清除的影响;通过共培养系统检测不同抗体对CD8+T细胞表面标志物的影响;网络药理学预测黄连素阿霉素调控中性粒细胞表型的分子机制;免疫荧光和Western bolt验证网络药理学预测的FOXO信号通路和JAK2-STAT3信号通路;使用JAK2-STAT3的小分子抑制剂WP1066验证黄连素阿霉素调控中性粒细胞的分子机制。最后使用meta分析方法分析NLR水平与癌症化疗的预后关系。体外研究结果显示,HL60经ATRA和TGF-β诱导后分叶核、细胞体积、相关细胞因子以及对肿瘤细胞活力出现明显差异;阿霉素持续诱导使HL60细胞向N2型中性粒细胞分化,从而诱导化疗耐药;黄连素联合阿霉素治疗可使HL60细胞向N1型分化;黄连素在不影响HL60和HL60-N1细胞增殖的情况下促进HL60-N2细胞凋亡,伴随着细胞分叶核明显、噬菌能力增强、CD66b表达降低、细胞体积减小。体内研究结果显示,在乌拉坦诱导的肺癌模型中,黄连素和LY6G-m Ab能够预防肺癌发生;而阿霉素单独使用促进中性粒细胞向N2极化,促进肺癌的发生,黄连素单独或联合阿霉素使用可使N1中性粒细胞恢复,防止肿瘤的发生,同时降低NLR水平,和血清PD-L1的水平,降低脾T淋巴细胞表面PD-1的表达,降低肺部组织CD31、tie2和CD309的表达和伊文思兰显示的血管通透性,增加脾脏细胞毒CD8+T细胞的比率。在H22异种移植瘤模型中,HL60-N1细胞注射对肿瘤生长起着抑制作用,而HL60-N2细胞注射促进肿瘤的生长。黄连素和LY6G-m Ab对肿瘤的生长无影响,但是能够维持中性粒细胞N1表型,促进阿霉素的抑瘤作用。骨髓中性粒细胞免疫分型、血清细胞因子和脾脏T淋巴细胞的结果与乌拉坦诱导的肺癌模型相似。在免疫再攻击模型中,阿霉素抑制肿瘤免疫排斥反应,黄连素促进其反应;黄连素阿霉素联合协同促进H22细胞的免疫排斥反应,伴随着骨髓N2中性粒细胞减少,肿瘤内血管渗透性减低,NLR水平降低,血清PD-L1和Th2细胞因子水平降低,脾T淋巴细胞PD-1表达降低,脾脏记忆性CD8+T细胞增加。机制研究结果显示:黄连素降低HL60-N2细胞自噬,增强线粒体和溶酶体的功能,降低ROS水平,促进HL60细胞分化。黄连素及其与阿霉素组合物能够促进细胞裂解,促进CD8+T细胞的免疫清除。HL-60-N2细胞产生更多PD-L1,促进CD8+T细胞表面受体PD-1表达。CD309抗体而不是CD66b和CD133抗体阻止了HL60-N2细胞中PDL1的产生和CD8+T细胞中PD-1的表达。网络药理学预测黄连素阿霉素调控中性粒细胞表型的分子机制与FOXO信号通路和JAK2-STAT3信号通路相关。免疫荧光和Western bolt结果显示其调控分子机制与JAK2-STAT3相关;使用WP1066验证了JAK2-STAT3通路是重要调控机制。meta分析结果显示,NLR水平与癌症患者化疗预后不良呈正相关。综上所述:中性粒细胞在阿霉素耐药中起着关键作用,黄连素选择性调控中性粒细胞表型维持免疫监测和癌细胞对阿霉素的敏感性,其机制与调控JAK2/STAT3-CD309-PD-L1信号级联反应相关。