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研究背景1,25-二羟基维生素D3(1α,25-dihydroxyvitamin D3,1,25(OH)2D3)是维生素D3(Vitamin D3,VD3)最重要的活性形式。2007年的统计资料表明,成年人VD3缺乏的发生率高达24%,而妊娠期妇女和老年人群的发生率比预计的更高。1,25(OH)2D3能调节钙磷代谢,维持骨骼矿化,预防佝偻病和骨质疏松的发生。近年的研究发现,胚胎期的1,25(OH)2D3缺乏能导致中枢神经系统发育异常。临床资料已提示,老年人群的1,25(OH)2D3缺乏与认知功能减退和老年性痴呆病的发生相关。阿尔茨海默病患者发生1,25(OH)2D3缺乏的比例显著高于同龄健康人群,并且1,25(OH)2D3受体(Vitamin D receptor,VDR)的表达有下调趋势。1,25(OH)2D3治疗能减缓老年大鼠海马脑区的萎缩。但是,有关1,25(OH)2D3缺乏是否影响认知功能迄今仍未见有明确的报道。在成年啮齿类和某些哺乳动物脑内,存在神经干细胞和神经前体细胞,这类细胞具有终生自我更新的能力,可以分化为神经细胞—成年神经发生(Neurogenesis)。在海马齿状回(Dentat Gyrus,DG),这些新生神经元显示了与成熟颗粒细胞相同的形态和功能特征,能与CA3区神经元和内嗅皮层的传入纤维建立突触联系,诱发突触传递和可塑性。特别是DG区的神经发生已被证实与空间认知功能密切相关,如新生神经元数量增多能提高学习记忆功能,而阻碍成年神经发生则造成记忆功能减退。本研究室的近期研究已证明,孕酮通过促进新生神经元的存活和成熟能增强空间认知功能,而β-淀粉肽通过阻碍新生神经细胞的分化和存活导致空间认知障碍。因此,成年的神经发生被认为能取代和修复由于自然老化或病变造成的神经元缺失,最大限度地维护脑的结构和功能的完整性。近年来,1,25(OH)2D3对多种肿瘤细胞的抗增殖、促凋亡和促分化作用引起了神经科学研究领域的广泛关注。妊娠期1,25(OH)2D3缺乏对脑发育的影响在近期已有较多的研究报道。1,25(OH)2D3缺乏能增加细胞周期调控蛋白如细胞周期素D1、细胞周期素B1和视网膜母细胞瘤蛋白表达,促进细胞的有丝分裂。在脑发育阶段,1,25(OH)2D3缺乏促进神经干细胞增殖,同时减少神经细胞死亡,从而导致脑的发育异常。1,25(OH)2D3缺乏引起体外培养室管膜下区神经元的神经球数量明显增加。但有关1,25(OH)2D3缺乏对成年神经发生的调节作用及其分子机制目前尚未见有报道。研究目的选用靶向敲除1α-羟化酶基因(1α(OH)ase-/-)小鼠作为成年1,25(OH)2D3缺乏的实验动物模型,研究1,25(OH)2D3缺乏对成年海马DG区神经发生的调节作用及其相关的分子机制,并探讨1,25(OH)2D3缺乏引起成年神经发生的改变对空间记忆功能的影响。实验方法1.生后7周龄的1α(OH)ase-/-小鼠血液循环中1,25(OH)2D3浓度已低到检测不出,将生后8周龄的1α(OH)ase-/-小鼠作为成年1,25(OH)2D3缺乏的实验动物模型。用剪尾提取DNA进行PCR扩增的方法来鉴定基因型。2.腹腔注射5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)标记有丝分裂细胞。分别在BrdU末次给药后24小时,第7天和第28天用免疫组织学技术检测BrdU标记的阳性细胞,以评价海马DG区新生神经细胞的增殖(24小时-BrdU+细胞)、存活(7天-BrdU+细胞)和分化(28天-BrdU+细胞)。3.用增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)染色法,检测海马DG区神经干细胞的增殖情况。分别用神经元特异性核蛋白(Neuron-specific nuclear protein,NeuN)或胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)与BrdU双标记免疫荧光染色法,检测海马DG区新生神经细胞的分化。用TUNEL细胞凋亡免疫染色法,检测海马DG区神经细胞的凋亡。用甲苯胺蓝染色法检测海马DG区的成熟颗粒细胞。4.分别用1,25(OH)2D3替代治疗、高钙高磷“补救饲料”喂养、或L-型电压门控钙通道(L-type voltage-gated calcium channel,L-VGCC)阻断剂尼非地平给药,并结合L-VGCC蛋白免疫荧光染色,来探讨1,25(OH)2D3缺乏调节成年海马DG区神经发生的分子机制。5.用Morris水迷宫实验法检测空间记忆功能。实验结果1.与同窝或同周龄的野生型小鼠相比,1α(OH)ase-/-小鼠海马DG区24小时-BrdU+细胞数和PCNA+细胞数都增加了近2倍,而7天-和28天-BrdU+细胞数均减少了大约50%。但是,1α(OH)ase-/-小鼠的BrdU+/NeuN+和BrdU+/GFAP+细胞占整个BrdU+细胞数的比值与同周龄野生型小鼠相比无统计学差异。2.补充1,25(OH)2D3能完全纠正1α(OH)ase-/-小鼠的24小时-BrdU+细胞增多和28天-BrdU+细胞减少。但是,喂养“补救饲料”恢复正常血钙磷水平对1α(OH)ase-/-小鼠的神经发生改变没有作用。3.与同周龄的野生型小鼠相比,成年1α(OH)ase-/-小鼠海马DG区的L-VGCC表达增多。L-VGCC阻断剂尼非地平给药能阻止成年1α(OH)ase-/-小鼠的24小时-BrdU+细胞增多,但不能改善7天-BrdU+细胞减少。4.与同周龄的野生型小鼠相比,8周龄1α(OH)ase-/-小鼠海马DG区发生凋亡的神经细胞增多,12周龄1α(OH)ase-/-小鼠海马DG区的成熟颗粒细胞数减少大约10%。5. Morris水迷宫行为学结果显示,12周龄1α(OH)ase-/-小鼠登台潜伏期比同周龄的野生型小鼠明显延长,喂养“补救饲料”恢复正常血钙磷水平对1α(OH)ase-/-小鼠的登台潜伏期延长没有作用,而补充1,25(OH)2D3能明显缩短1α(OH)ase-/-小鼠的登台潜伏期。结论1. 1,25(OH)2D3缺乏促进海马DG区神经干细胞增殖,但又阻碍新生神经细胞的存活,并不影响神经前体细胞的分化。2. 1,25(OH)2D3缺乏是成年神经发生异常的主要原因,低钙血症和低磷血症并不参与1,25(OH)2D3缺乏引起神经发生改变的过程。1,25(OH)2D3缺乏可能是通过上调L-VGCC表达和增加钙内流,促进神经干细胞增殖。3. 1,25(OH)2D3缺乏通过损伤成年神经发生导致海马DG区的颗粒细胞数减少,是空间记忆功能减退的原因之一。我们的研究结果提示,1,25(OH)2D3缺乏能损伤成年神经发生,导致认知功能减退和促进老年性痴呆的发生。补充1,25(OH)2D3,而不是调节血钙和血磷水平,能更有效地预防和治疗由VD3缺乏所导致的成年神经发生障碍,并有可能改善老年人群和脑损伤患者的认知功能。