卵巢癌是严重威胁妇女健康的常见恶性肿瘤,死亡率在女性生殖器恶性肿瘤中占第1位。目前理想的肿瘤细胞减灭术和术后以铂类为主的联合化疗是卵巢癌的标准治疗方案。虽然70%以上的卵巢癌患者对以铂类为基础的化疗能获得临床缓解,但卵巢癌患者预后不佳,5年生存率不到30%。肿瘤细胞原发性或继发性的化疗耐药使肿瘤复发转移的主要原因,严重影响卵巢癌治疗效果及生存率,已经成为目前卵巢癌治疗难以突破的瓶颈[1]。肿瘤细胞的化疗耐药机制目前尚未阐明,寻求有效的途径克服卵巢癌化疗耐药是提高卵巢癌化疗疗效的关键环节。铂类药物的主要靶点为DNA,通过和细胞内DNA形成链内和链间加合物,从而阻断DNA复制转录,造成细胞死亡。因此肿瘤细胞的DNA修复机制可能在肿瘤细胞的化疗耐药中发挥重要作用。有证据表明,耐药的肿瘤细胞中普遍出现了DNA损伤修复能力提高[2-4],肿瘤细胞对铂类所致DNA损伤的修复能力(DNA repair capability, DRC)增强很可能是癌细胞对铂类药物产生耐药的最重要机制[5]。因此以DNA损伤修复基因为靶点的肿瘤靶向治疗可能会逆转肿瘤细胞的化疗耐药。现有的研究表明,双功能酶APE1/Ref-1不仅具有核酸内切酶活性,在碱基切除修复途径(Base excision repair, BER)中发挥关键限速酶作用,而且还能通过其氧化还原功能调控多种重要转录因子的活性,在凋亡信号通路中发挥重要作用。APE1/Ref-1是联系DNA损伤修复、氧化应激、凋亡通路及细胞周期调控等多种重要生物学反应的桥梁分子。此外,还有多项研究表明,APE1/Ref-1的表达和定位与多种肿瘤的发生发展及其放化疗敏感性相关。因此我们有充分的理由相信,APE1/Ref-1是非常有潜力的肿瘤治疗靶点[6-7]。在我们的前期工作中,我们发现APE1/Ref-1在铂类耐药的卵巢癌组织和耐药的卵巢癌细胞中均发生表达水平增高和细胞定位改变,提示APE1/Ref-1在胞核和胞浆中发挥作用不同,可能是铂类耐药的重要环节。在我们的另一项研究中,曾以卵巢癌顺铂耐药细胞株CP70为研究对象,用APE1 siRNA特异性下调APE1/Ref-1表达后,CP70细胞对顺铂的敏感性显著增强,并与细胞周期阻滞有关[138-139]。为了进一步验证APE1/Ref-1在卵巢癌铂类耐药形成中发挥的作用,本课题首先以卵巢癌铂类敏感和铂类耐药的配对临床资料为研究对象,用免疫组化分别对APE1/Ref-1、MDR1和p53基因表达水平进行检测,进一步验证APE1/Ref-1与卵巢癌铂类耐药及耐药相关基因之间的关系。随后我们将根据APE1/Ref-1两大功能相互独立发挥作用的结构特点,分别构建不同功能结构域的APE1/Ref-1重组质粒。然后以卵巢癌顺铂敏感细胞株A2780细胞为研究对象,观察APE1不同重组质粒对卵巢癌细胞的生物学效应及铂类敏感性的影响,初步探讨APE1/Ref-1的不同功能状态参与卵巢癌铂类耐药的机制。本研究将为APE1参与卵巢癌铂类耐药提供更有力的直接证据,为进一步阐明APE1/Ref-1参与卵巢癌铂类耐药的机制奠定基础,具有重要的理论意义和临床应用前景。研究目的1.从临床资料病理组织水平验证APE1/Ref-1表达与卵巢癌铂类敏感性的相关性;2.构建不同功能结构域的APE1/Ref-1重组质粒,为研究APE1/Ref-1与铂类耐药的相关性提供有效手段;3.探讨APE1/Ref-1不同功能状态对卵巢癌生物学行为及顺铂敏感性的影响,为进一步阐明APE1/Ref-1参与卵巢癌铂类耐药的机制奠定基础。研究方法1.以卵巢癌铂类敏感和铂类耐药的配对临床资料为研究对象,用免疫组化分别对临床病理组织标本中APE1/Ref-1、MDR1和p53基因表达水平进行检测,进一步验证APE1/Ref-1与卵巢癌铂类耐药及耐药相关基因之间的关系。2.利用重组质粒技术,针对APE1/Ref-1不同功能结构域构建APE1-pEGFP-N1、Redox-pEGFP-N1、Repair-pEGFP-N1和NLS- Repair-pEGFP-N1四种APE1不同结构域的重组质粒。3.利用脂质体法将APE1/Ref-1不同重组质粒分别转染卵巢癌铂类敏感细胞株A2780细胞,荧光显微镜下观察EGFP表达检测转染效率;4. RT-PCR和western blot分别检测APE1-pEGFP-N1质粒转染后A2780细胞中APE1/Ref-1蛋白水平和mRNA水平;5. G418抗性筛选,获得稳定转染APE1-pEGFP-N1和空质粒pEGFP-N1的A2780细胞株;6. MTT法分别绘制卵巢癌A2780细胞分别转染APE1不同重组质粒后生长曲线的变化;7.平板克隆形成试验检测稳定转染APE1-pEGFP-N1的A2780细胞株的增殖能力变化;8.流式细胞术检测卵巢癌A2780细胞分别转染APE1不同重组质粒后细胞周期的变化,并计算增殖指数;9. MTT法检测卵巢癌A2780细胞分别转染APE1不同重组质粒后顺铂敏感性的变化;10.免疫荧光检测APE1不同重组质粒转染后,A2780细胞中APE1/Ref-1表达及定位的变化。11.流式细胞术检测APE1不同重组质粒转染对顺铂诱导的A2780细胞凋亡的影响。研究结果1.卵巢癌铂类耐药组中APE1高表达和浆表达的比例均明显高于敏感组,两者之间有统计学差异(p<0.05);2.当APE1出现浆表达时,在耐药组中p53蛋白的阳性率较敏感组明显增高,两者差异有统计学意义(p<0.05);3. APE1-pEGFP-N1重组质粒转染后,MTT法绘制生长曲线提示A2780细胞生长速度有所提高,克隆形成试验提示A2780单个细胞增殖能力有所提高;4.细胞周期结果表明,与对照组相比,APE1-pEGFP-N1转染重组质粒转染后,A2780细胞G0/G1期比例降低,G2+S期比例增加,有统计学差异(p<0.05);5. APE1-pEGFP-N1重组质粒转染组和空质粒转染组相比,增殖指数(PI)有所升高(52.4% vs. 59.5%),提示APE1-pEGFP-N1转染能促进A2780细胞的生长增殖;6. APE1-pEGFP-N1转染组和Redox-pEGFP-N1转染组增殖指数(PI)分别为60.57%和63.03% ,出现了增殖指数增加的现象;而Repair-pEGFP-N1转染组和NLS-Repair-pEGFP-N1转染组增殖指数分别为41.7%,36.65%,较阴性对照组降低。7.与阴性对照组和空白对照组相比,APE1-pEGFP-N1和Redox-pEGFP-N1转染组出现G0/G1期比例降低, S期比例增加的现象,而Repair-pEGFP-N1和NLS-Repair-pEGFP-N1转染组出现了G0/G1期比例增高,S期比例降低的现象;8.在相同的药物浓度下, APE1-pEGFP-N1、Redox-pEGFP-N1、Repair-pEGFP-N1和NLS-Repair-pEGFP-N1四组转染后,顺铂对A2780细胞的抑制率均有所降低,根据IC50值由高到低依次为Redox-pEGFP-N1、NLS-Repair-pEGFP-N1、APE1-pEGFP-N1和Repair-pEGFP-N1(IC50值分别为28.01μM、24.00μM、19.21μM和16.71μM),A2780细胞对顺铂的耐受性分别提高了2.13倍、1.46倍、1.27倍和1.83倍(p<0.05)。9. APE1-pEGFP-N1转染组和阴性对照组相比,活细胞率略有升高(98.0% vs. 97.2%),凋亡率略有下降(1.1% vs. 1.6%)。Redox-pEGFP-N1转染组凋亡率和坏死率分别为1.7%和0.8%,和阴性对照组相比无明显差异。Repair-pEGFP-N1和NLS-Repair-pEGFP-N1两组中活细胞率分别为93.3%和92.8%,和对照组相比略有降低,而凋亡率略有所增加,分别为4.4%和4.6%。10. APE1-pEGFP-N1转染组和顺铂处理组相比,凋亡率略有升高(8.4% vs. 6.6%),坏死率显著降低(28.4% vs. 41.3%)。Redox-pEGFP-N1转染组凋亡率和坏死率和顺铂处理组相比均有所降低,其中坏死率降低更为显著(5.5% vs. 6.6%,24.1% vs. 41.3%)。转染不同APE1重组质粒的四组细胞与顺铂处理组相比,Repair-pEGFP-N1和NLS-Repair-pEGFP-N1两组坏死率降低最为明显,分别为22.3%和23.7%,但凋亡率有所增加,分别为20.5%和13.5%。结论1. APE1/Ref-1的表达水平和细胞定位均与卵巢癌铂类耐药相关,其参与卵巢癌铂类耐药的机制可能与P53突变相关。2.提高APE1/Ref-1表达水平能通过促进A2780细胞DNA合成而对A2780细胞产生刺激增殖作用,并增加A2780细胞对顺铂的耐受性。3. APE1/Ref-1的不同功能状态对A2780细胞周期及DNA合成有调控作用。APE1/Ref-1表达增高能促进肿瘤细胞中蛋白质合成,而APE1/Ref-1的氧化还原功能在这一过程中扮演重要角色。4. APE1/Ref-1的氧化还原功能和DNA修复功能都在卵巢癌A2780细胞对顺铂的化疗应激中发挥了一定作用。其中APE1/Ref-1的氧化还原功能对A2780细胞顺铂敏感性影响最为显著,可能与APE1通过氧化还原功能调控下游凋亡相关因子从而对抗顺铂诱导的细胞凋亡有关。而APE1/Ref-1的DNA修复功能也通过DNA修复酶活性在A2780细胞对顺铂的抵抗中发挥一定作用。