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视网膜缺血再灌注损伤是眼科常见的病理过程以及致盲的主要原因。已有众多研究证实视网膜缺血再灌注损伤导致细胞凋亡且伴有视网膜细胞内Ca2+浓度的升高。钙蛋白酶（calpains）是一种全身广泛存在的中性限制性钙蛋白水解酶。在病理状态下,异常增高的Ca2+浓度可激活calpains,引起疾病的发生。E-64d是一种具有细胞膜高通透性的、与calpains的Ca2+结合位点高度选择性结合的calpains抑制剂,已被证实对神经系统有较好的抗蛋白水解作用。本研究从形态学水平、细胞学水平、蛋白质水平和分子水平四个层次研究了急性高眼压诱导的视网膜缺血再灌注后视网膜神经上皮水肿和坏死程度、细胞凋亡、calpains的蛋白表达和mRNA的改变,以及calpains抑制剂E-64d对上述改变的抑制作用,探讨了以急性高眼压动物模型研究视网膜缺血再灌注发病机制的可行性,calpains在其发生机制中的作用及机理,以及E-64d对视网膜缺血再灌注的预防作用。第一部分急性高眼压性视网膜缺血再灌注损伤模型的建立目的:本研究将急性高眼压诱发大鼠视网膜缺血再灌注损伤作为实验模型,来研究急性高眼压对视网膜的水肿、细胞形态学改变以及视网膜神经元细胞凋亡的影响,探讨将急性高眼压诱发的缺血再灌注损伤作为动物模型研究其发病机制的可行性。方法:采用清洁级200～300g SD大鼠。将连接生理盐水输液管的20号留置针刺入大鼠前房,然后升高升高输液瓶形成109.7 mmHg的眼压,持续1h后降低输液瓶高度至动物水平,拔出前房灌注针头,可见眼结膜充血,恢复血液供应,缺血再灌注后1、3、6、24、72h处死动物,摘除眼球。标本常规10%中性多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片,HE染色后置光镜下观察。Bax和m-calpain蛋白表达测定采用免疫组化方法。结果:SD大鼠视网膜缺血再灌注后1～24h,光镜可见视网膜明显水肿,神经元细胞胞体及线粒体肿胀,细胞膜崩解,核染色体不规则分布,细胞坏死。细胞坏死最早见于再灌注1h后,72小时视网膜变薄。在细胞坏死的同时可见凋亡,凋亡相关蛋白Bax在急性高眼压导致缺血的视网膜各层细胞的表达上调,呈强阳性反应。随着再灌注作用时间的延长,钙蛋白酶m-calpain阳性细胞百分比逐渐增多。结论:本研究证实了急性急性高眼压确可诱发视网膜神经元细胞坏死、凋亡,视网膜萎缩变薄,在细胞坏死的同时可见凋亡,凋亡相关蛋白Bax以及钙蛋白酶m-calpain表达上升,将急性急性高眼压性模型作为动物模型研究视网膜缺血再灌注损伤的发病机制中有一定可行性。第二部分:急性高眼压诱导的视网膜缺血再灌注损伤中的凋亡及钙蛋白酶表达目的:探讨caspase-3、m-calpain、calpastatin蛋白相关的细胞凋亡、以及钙蛋白酶在急性高眼压诱导的视网膜缺血再灌注损伤中的发生机制中的作用。方法:用急性高眼压诱发大鼠发生视网膜缺血再灌注损伤,用western-blot的方法研究m-calpain蛋白、caspase-3的表达,用RT-PCR法测定calpains、calpastatin的mRNA的改变,并与对照组进行比较。结果:SD大鼠在视网膜缺血再灌注前均有m-calpain和caspase-3蛋白的基础表达。缺血再灌注后24 h m-calpain和caspase-3的表达均较正常组上升,视网膜缺血再灌注后m-calpain/calpastatin的比值在6h后增加,24h达到最高峰,72h后开始回落。结论:急性高眼压诱导大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的细胞凋亡,m-calpain和caspase-3的表达上升,缺血损伤导致calpain/calpastatin的比例上升。第三部分:钙蛋白酶抑制剂E-64d对急性高眼压诱导的视网膜缺血再灌注损伤预防作用目的:探讨E-64d（半胱氨酸蛋白酶抑制剂）在大鼠视网膜缺血再灌注损伤（RIRI）中对calpain和caspase-3表达的调节作用。方法:将SD大鼠随机分为视网膜缺血再灌注组,E-64d治疗组和正常组。通过前房穿刺加压法制成视网膜缺血再灌注损伤（RIRI）动物模型,缺血再灌注分为1、3、6、24、72小时5个时间段。采用Western-blot以及RT-PCR方法测定在大鼠视网膜缺血再灌注损伤的calpian蛋白和mRNA表达情况以及caspase-3的蛋白表达改变。结果:缺血再灌注后24小时m-calpain、caspase-3蛋白的表达均较正常组上升,而玻璃体腔注射E-64d组m-calpain、caspase-3蛋白表达与正常组相似,比缺血再灌注组下降。视网膜缺血再灌注后m-calpain/calpastatin mRNA的比值在6小时后上升,24小时达到最高峰,72小时后开始回落,其中缺血再灌注组6小时、24小时、72小时与正常组比较P值均小于0.05,其差异有显著统计学意义;E-64d组与视网膜缺血再灌注24小时组比较,P值小于0.05,其差异也有显著统计学意义。但是三组的m-calpain和calpastatin mRNA转录强度差异均无显著的统计学意义（P＞0.05）。结论:E-64d作用后较缺血再灌注同一时间段的视网膜细胞形态明显好转,水肿减轻,视网膜各层细胞m-calpain蛋白阳性率明显下降。E-64d能降低视网膜缺血再灌注时m-calpain、caspase-3蛋白的表达,调控m-calpain/calpastatin的mRNA比值。可能对视网膜的缺血再灌注损伤有保护作用。