硝基苯作为单环芳烃硝基取代化合物的代表,一直作为重要的化工原料广泛应用于工业生产中,因此在制药、苯胺、杀虫剂、染料等工业的废水中有大量残留。由于苯环的取代基硝基的强吸电子作用导致苯环本身被钝化而很难被亲电攻击,因此硝基苯非常稳定,不易被降解。硝基苯具有较大的毒性,且易于挥发在空气中,造成污染。物理化学方法被广泛应用于硝基苯污染的治理,而生物降解的方法被认为是最有前途的方法,具有低成本、无二次污染、生态恢复性好的优点。因此倍受国内外研究人员关注。目前由于大量不同无机污染物或有机污染物共存于环境中,造成了环境中的复合污染问题。而硝基苯废水中就常常会存在重金属的无机污染,以及苯酚、苯胺等有机的复合污染。因此,针对这种情况本研究从硝基苯高效降解菌的分离筛选入手,进而研究其降解特性筛选能够应对复合污染的硝基苯降解菌作为研究对象,解析其降解途径和克隆降解相关基因；并从应用角度出发,通过固定化技术进一步强化菌株对污染物的耐冲击和降解能力,为今后用于实际废水的处理提供理论依据。1.硝基苯降解菌的分离和鉴定通过富集培养法从含有硝基苯的复合污染的水样中分离筛选高效硝基苯降解菌株,获得6株能够以硝基苯为唯一碳、氮、能源生长的硝基苯降解菌株(B4、C1、F、S7、a3和D4)及1株能转化硝基苯但不能以其为碳源生长的菌株S6-2-9。根据生理生化鉴定结果和16S rRNA基因序列同源性分析,将菌株B4、Cl、F、S7、a3初步鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas),将D4和S6-2-9初步鉴定为贪铜菌属(Cupriavidus)。2.硝基苯降解菌D4的降解特性、代谢途径和cnb基因的克隆菌株Cupriavidus sp.D4是能以硝基苯和4-氯硝基苯为唯一的碳、氮、能源生长且具有多种重金属抗性的降解菌株。它是潜在的能应用于重金属污染下的硝基苯或4-氯硝基苯的有机污染修复中的种质资源。菌株D4降解硝基苯的最适温度为30℃,最适pH值为7.0。它对锌、锰、钴、镉、铅以及砷酸根等离子表现出较好的抗性,而镍、汞、银、铜及铬酸根离子则会极大地抑制菌株D4对硝基苯的降解。分别以硝基苯和4-氯硝基苯为底物研究了D4降解它们的中间代谢产物,结果显示D4是以部分还原途径降解两种底物的。克隆了菌株D4降解4-氯硝基苯的相关基因cnb基因,对其相似性分析显示,它们与已报道的cnb基因同源性很高,说明4-氯硝基苯降解菌的cnb基因具有高度的保守性。D4的cnb基因被定位于两个质粒上,这与已报道的4-氯硝基苯降解菌株Comamonas sp.strain CNB-1的cnb基因定位不同。另外,在菌株D4和S6-2-9中都克隆到了与砷抗性相关的砷还原酶抗性基因的部分序列,它与已报道的对氯硝基苯降解菌CNB-1的相应序列同源性为100%。3.硝基苯降解菌a3的降解特性、代谢途径研究及关键酶基因的克隆分析菌株a3具有较宽的降解谱,它不但能降解硝基苯,还能在硝基苯、苯酚和苯胺共同存在的体系中同时降解这三种污染物,彼此不存在底物竞争抑制现象。在分析a3降解硝基苯的代谢产物中发现了苯胺的存在,这意味着a3菌株中可能存在不同于传统的硝基苯降解途径(部分还原途径),以苯胺为底物的降解实验显示,苯胺被菌株a3进一步降解的途径是,先被羟化为2-氨基酚,而后通过间位开环进一步降解。这一途径也是未被报道过的新的苯胺降解途径。为了研究菌株a3中多组分苯酚羟化酶是否是对苯胺进行羟化的功能酶,我们首先通过PCR的方法克隆了编码羟化酶大亚基的基因片段,以此为同源臂构建插入突变载体对菌株进行了插入突变,结果显示多组分羟化酶正是对苯胺进行羟化作用的酶。在此基础上,通过SEFA-PCR和常规PCR的方法克隆了多组分羟化酶的完整序列和上游调节基因的部分序列以及下游开环酶基因的完整序列,它们共同组成一个基因簇,命名为pll基因簇(pllRKMNOPLQB)。通过对pll基因簇的分析试图找出菌株a3能够羟化苯胺的原因。pllKMNOPL的完整多组分羟化酶基因与其它相应基因有着高度的同源性,而该多组分羟化酶的底物多为苯酚或者苯酚衍生物,而在本研究中发现该酶在菌株a3中是被用来对苯胺这种底物进行羟化的,而间氯苯胺及3,4-二氯苯胺也是该羟化酶的作用底物,a3的这种底物特异性不同于其它也具有该羟化酶的菌株。于是,对该多组分羟化酶的上下游基因进行了分析,特别是通过对于上游调控基因部分序列的分析发现：pllR应属于Ntrc调控蛋白家族,在该调控基因的N端(据报道Ntrc调控蛋白N端为效应物结合区)与其它Ntrc调控蛋白家族的调控蛋白有着一定差异,很有可能是调控菌株a3中的羟化酶羟化苯胺等底物的调控蛋白。4.硝基苯降解菌株a3的细胞固定化及其在处理含硝基苯的复合污水中的应用研究近年,细胞固定化处理废水新技术成为各国学者研究的热点,固定化后的细胞具有密度高、反应速度快等优点,而且具有保护被固定微生物,提高微生物抗污水的高毒性冲击的能力。对于硝基苯复合污染中的各种有毒有害物质对生物高毒性的特点,以固定化技术来改善硝基苯降解微生物的对污染物的修复效果无疑是一个好的选择。本研究尝试了用活性炭吸附和海藻酸钠(SA)包埋的方法固定化菌株a3,虽然固定化后菌株降解效率有所提高,但活性炭和海藻酸钠载体由于机械强度差而被放弃。最终选择了用机械强度较好的聚乙烯醇(PVA)与海藻酸钠(SA)的混合载体来包埋固定化菌株a3,并用正交试验的方法确定了最优包埋方案为：海藻酸钠浓度3%,PVA浓度9%,CaCl2浓度1%,包埋比为4：25。得到的固定化载体最适降解温度为30℃,最适pH值为7,3%的NaCl会抑制固定化细胞对硝基苯的降解。固定化的菌株a3能分别高效降解硝基苯、苯酚和苯胺相比于游离态降解速率都有了较大提高。通过苯酚、苯胺与硝基苯的混合底物降解试验,发现固定化细胞对硝基苯的降解基本不受混合底物的影响,在8h内可基本降解300mg/L的硝基苯,并能把与硝基苯共底物的苯酚、苯胺同时降解掉。而游离态细胞则受苯酚、苯胺添加的干扰较大。固定化细胞在连续化降解和模拟曝气试验中,保持了较好连续降解性能,且具有很好的机械强度。这些固定化细胞所应具有的高效、持久耐用及耐冲击等特点在试验结果中都得到了很好的体现,说明固定化技术对于菌株a3的应用起到了很好的效果,为今后进一步的应用于实际废水中提供了理论依据。本论文分离了6株硝基苯降解菌和1株转化菌,并详细研究了其中的具有重金属抗性的能以硝基苯和对氯硝基苯为唯一碳、氮、能源生长的贪铜菌属(Cupriavidus)降解菌D4,以及能同时降解硝基苯、苯酚、苯胺等多种芳香化合物的假单胞菌属(Pseudomonas)降解菌株a3。研究了它们的降解特性和代谢途径,发现在菌株a3中存在硝基苯和苯胺的新的代谢途径。从菌株a3中克隆到了多组分羟化酶基因簇,并分析了其上游的调节基因具有不同于其它相关基因的调控能力。进行了菌株a3的固定化应用研究,结果显示出了将该固定化细胞用于复合有机污水处理中的应用潜力。