天冬酰胺合成酶(Asparagine Synthetase-B, AS-B, EC 6.3.5.4)是植物体内氮素同化的关键酶,其产物天冬酰胺(Asn)参与有机氮素的运输和储存。研究编码该酶基因的功能,对理解林木的氮代谢的机制有重要作用。本研究以小黑杨(P.simonii XP.nigra)为实验材料,克隆AS基因,分析不同家族成员对全组织表达、日节律、持续光照/黑暗48h处理、氮素及MSX处理的响应。将PnASl构建植物表达载体,采用农杆菌介导法转化84K杨,经过抗性筛选和PCR鉴定,获得了7个转化子；对转基因植株进行不同水平氮素处理,并测定根和叶中有关生理形态和氮代谢的相关指标。主要结论如下：(1)以小黑杨为材料,通过同源克隆的方法得到3个AS基因家族成员,分别命名为PnAS1、PnAS2和PnAS3,长度分别为1770bp、1755bp和1764bp,并成功提交NCBI数据库,登录号分别为KT161263、KT161264和KT161265。(2)大肠杆菌天冬酰胺突变体ER回复实验证明,转入pET-14b-PnAS1、pET-14b-PnAS2和pET-14b-PnAS3质粒的菌液均能恢复生长,从而证明PnAS1、PnAS2和PnAS3具有合成天冬氨酸合成酶的功能。(3)全组织表达分析显示,PnAS1和PnAS2主要在地上部位的叶片中表达,但是二者的表达部位存在差异,即PnAS1主要存在于叶片L2和L3, PnAS2主要在幼嫩叶叶片L1中表达。同时,三个基因均在根中大量表达。(4)日节律的实验结果表明,幼叶L1中PnAS2的表达占优势且有一定的波动,PnAS1较为稳定。L2中两个基因的表达趋势一致,但PnAS1更易受黑暗条件的影响。(5)持续光照/黑暗48h处理,PnASl和PnAS3受到光照抑制和黑暗诱导,黑暗条件下两个基因的转录水平是光照条件下的50-200倍,PnAS2基因在部分叶片中受光照抑制,其不受黑暗条件的影响。(6) PnAS1、PnAS2和PnAS3对不同氮素形态、不同供氮水平及不同处理时间的响应表达模式进行研究表明：L1中,两种氮素形态均可诱导PnAS1表达,但响应时间有差异,对硝态氮响应较快。L2叶片中,两个基因均被抑制。L3中,AS基因对硝酸铵的的响应高于硝和铵。小黑杨根部的PnAS1和PnAS3两个基因强烈诱导表达,因此根部是AS基因诱导的主要部位。利用MSX进行处理证实,根部NH4+对PnAS3强烈诱导是通过合成Gln或者Gln衍生物发挥的作用。(7)利用农杆菌介导法转化84K杨树,经过卡纳筛选、分子鉴定,确认获得7个转基因株系。(8)正常氮素处理(0.5mM NH4NO3)条件下,转基因植株的地上及地下鲜重均显著增加且氨基酸的含量高于野生型植株,转化子3除外,转化子3和4的GOGAT的酶活高于野生型。低氮胁迫处理条件下(0.05mM NH4NO3),转化子1、3、5和7的氮素利用率明显提高；各个转化子的生物量、叶面积及氨基酸的量均高于野生型,除此之外,转化子3、4、5和7的GOGAT酶活同样高于野生型植株。综上所述,小黑杨中的三个ＡS基因家族成员,能够回复天冬酰胺突变体ER,且具有ＡS基因的一般特征：时空特异性表达及受光照/黑暗和氮素的影响。低氮条件下,转PnAS1的84K杨在氮素利用率、生物量、氨基酸等方面表现优良。