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癌症是威胁人类健康的重大安全隐患,全球致死率高达13%,且近年来其发病率和死亡率呈明显上升的趋势。研制安全有效的癌症治疗手段是当前全人类面临的重大挑战。目前研究发现,将化疗与基因治疗联合的治疗方案能增强基因转染效率,增强化疗药物的疗效,产生有效的抗肿瘤协同效应。RNA干扰(RNA interfering, RNAi)技术是一种有效调控基因表达量的技术,它通过体外导入双链RNA (double strand RNA, dsRNA)特异性沉默体内信使RNA (messenger RNA, mRNA),从而阻断其蛋白翻译。该技术开辟了基因研究的新领域,自2006年诺贝尔生理学和医学奖获得者强调其重要意义以来,已经被广泛应用于包括病毒性肝炎、心血管疾病、艾滋病以及恶性肿瘤在内的多种疾病的治疗。基于小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)诱导的高效基因沉默效率,将RNAi与化疗结合的联合疗法是当前肿瘤治疗研究的热点。要获得理想的RNAi与化疗协同抗肿瘤效果,共递送载体的设计尤为关键。目前主要采用不同装载机制分步组装构建共递送体系。开发一步共装载技术可简化共递送体系的制备工艺,利于临床转化。对一步共装载技术来说,如何选取合适的载体减小药物与基因性质的差异是其关键。本课题选取选取富含CGA重复序列的寡聚核苷酸(Oligodeoxynucleotides with CGA repeating units, CGA-ODNs)为结合型寡聚核苷酸,利用其可以与抗肿瘤药物多柔比星(Doxorubicin, Dox)特异结合的性质,制备载药寡聚核苷酸(Dox loaded CGA-ODNs, CGA-ODNs-Dox)。CGA-ODNs-Dox与siRNA理化性质相似,可与siRNA以任意摩尔比混合。CGA-ODNs-Dox与siRNA的混合物(mixture of CGA-ODNs-Dox and siRNA, CGA-ONDs-Dox&siRNA, DR)可被阳离子聚合物聚乙烯酰亚胺(Polyethylenimine, PEI)压缩,一步装载即可获得Dox与siRNA共载纳米粒(PEI/CGA-ODNs-Dox&siRNA, PDR)。PDR进一步静电吸附负电性多功能材料羧甲基壳聚糖-聚乙二醇-NGR (CMCS-PEG-NGR, CPN),形成CPN修饰的Dox与siRNA共载纳米粒(CPN modified PDR, CPN-PDR)。本课题采用抗血管内皮生长因子(Vescular Endotheliol Growth Factor, VEGF) siRNA为模型基因制备PDR和CPN-PDR,首先考察制备处方和工艺、PDR和CPN-PDR的理化性质、细胞摄取及细胞内分布；然后评价纳米粒材料和空白纳米粒的细胞毒性、共载纳米粒的细胞毒性和体内初步安全性,为进一步开展体内研究提供实验基础。主要研究方法和结果如下：1.多柔比星在不同pH条件下含量测定方法的建立本部分主要采用荧光分光光度法建立体外Dox在不同pH介质中含量测定方法,分别对测定方法的线性范围、精密度和回收率进行考察。实验结果表明Dox在pH5.0、pH6.0和pH7.4条件下荧光强度与浓度在一定浓度范围内线性良好,精密度、回收率均符合测定要求。2.一步共装载技术构建共载纳米粒及其理化性质评价本部分以抗VEGF siRNA为模型基因,Dox为模型药物制备PDR和CPN-PDR.首先采用室温孵育的方法以CGA-ODNs为Dox的装载材料,制备载药寡聚核苷酸CGA-ODNs-Dox,以荧光分光光谱扫描对CGA-ODNs-Dox的装载比和稳定性进行评价,以MTT法对CGA-ODNs-Dox的细胞毒性进行考察；其次采用琼脂糖凝胶电泳对PEI压缩CGA-ODNs-Dox与siRNA混合物的能力及CPN静电吸附形成CPN-PDR的情况进行考察,确定最优处方；采用透射电镜观察PDR、CPN-PDR的形态,激光粒度测定仪测定其粒径、粒度分布及电位；最后采用动态膜透析法对药物释放行为进行考察。实验结果表明CGA-ODNs与Dox的最佳装载比例为1：5；稳定性实验结果表明CGA-ODNs-Dox在4℃条件下12h内稳定,在pH7.4条件下稳定,在pH5.0条件下不稳定；MTT结果显示CGA-ODNs-Dox在A549和HepG2细胞上的细胞毒性与游离Dox相当；处方筛选确定PDR最优PEI/ODNs&siRNA质量比为1：1,最优CPN/ODNs&siRNA质量比为4：1,最优处方制备的PDR和CPN-PDR均呈球形或类球形,平均粒径分别为91.9±2.6 nm和144.4±3.9 nm,电位分别为12.56±0.94 mV和-7.04+1.72 mV,多分散指数PDI均小于0.25；体外释放结果显示在pH5.0条件下Dox从CPN-PDR中释放显著快于在pH7.4条件下,药物释放有一定的pH敏感性。3.共载纳米粒胞内递送药物与基因的研究本部分以FAM标记的阴性对照siRNA (FAM labelled siRNA, FAM-siRNA)为模型基因,借助FAM的绿色荧光和Dox的红色荧光,对共载纳米粒摄取入胞过程进行考察。首先采用流式技术对细胞表面的CD1 3受体表达量进行测定；其次采用MTT法对纳米粒材料和空白纳米粒的细胞毒性进行考察；采用荧光拍照和流式技术对PDR的摄取进行测定；通过细胞核定位的方法对CPN-PDR在pH5.0、pH6.0和pH7.4培养基条件下的摄取进行观察；采用激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scan Microscopy, CLSM)对CPN-PDR在A549细胞上的竞争性摄取进行观察和定量；最后标记溶酶体对FAM-siRNA和Dox的溶酶体逃逸情况进行观察。经流式测定,A549细胞表面CD13阳性率为91.52%,为CD13阳性细胞株,HepG2细胞阳性率为2.24%,为CD13阴性细胞株；MTT实验结果显示CGA-ODNs和CPN细胞毒性低,有良好的生物相容性,PEI有明显的细胞毒性；空白共载药物与基因纳米粒(blank PDR,bPDR)细胞存活率低于CPN修饰的空白共载药物与基因纳米粒(CPN modified bPDR, bCPN-PDR),有明显细胞毒性,在高浓度其细胞毒性更为明显；流式数据显示PDR在A549细胞和HepG2细胞的共递送FAM-siRNA和Dox的效率分别为39.52%和36.78%；对细胞核定位后摄取结果显示,CPN-PDR在pH5.0条件下,细胞内Dox的红色荧光与细胞核蓝色荧光叠加形成的紫色荧光显著增强；靶向竞争抑制实验结果表明,CPN-PDR在未经游离NGR孵育条件下细胞内的红色荧光强度和绿色荧光强度分别为游离NGR孵育条件下的1.77倍和1.90倍；对溶酶体进行定位,CLSM照片显示Dox在1h即能逃出溶酶体,开始聚集于细胞核,2h时基本完全进入细胞核内,FAM-siRNA在1h基本与红色溶酶体重叠,在2h可观察到成功的溶酶体逃逸。4.共载纳米粒细胞毒性及体内安全性初步评价本部分以对Dox敏感的人乳腺癌细胞株MCF-7为模型细胞,采用MTT法对纳米粒材料和空白纳米粒进行评价；采用荧光实时定量PCR(RealTime-PCR)和Western Blot技术对基因转染效率进行考察；采用MTT法对CPN-PDR的细胞毒性进行评价；最后采用溶血实验和组织切片实验对CPN-PDR的安全性进行初步考察。MTT实验结果显示,与MCF-7细胞孵育72h, CGA-ODNs和CPN无明显毒性,PEI细胞毒性随浓度的升高而增强,在高浓度尤为明显；bPDR细胞毒性在24h与bCPN-PDR无显著性差异,随时间延长,bPDR表现出细胞毒性,在48h和72h其细胞存活率显著低于bCPN-PDR (P<0.05);体外转染mRNA水平检测结果显示递送抗VEGF siRNA能显著降低细胞内VEGFmRNA水平,CPN修饰的单载siRNA纳米粒(CPN modified PEI/siRNA, CPN-PR)、CPN-PDR与Lipo/siRNA均无显著性差异；Western Blot显影照片显示转染48h CPN-PDR组能明显降低VEGF蛋白的表达量,与mRNA水平检测结果一致；细胞毒性实验结果显示CPN-PDR IC50值显著低于游离药物Dox和CPN修饰的单载Dox纳米粒(CPN modified PEI/siRNA, CPN-PD),共载纳米粒细胞毒性显著增强(P<0.05)；溶血实验结果显示CPN-PDR不会引起红细胞溶血；组织切片观察结果显示,小鼠给予CPN-PDR后各器官组织特征与生理盐水组无显著差异,二者均无明显病理变化,初步表明其良好的体内安全性。综上所述,本课题基于结合型寡聚核苷酸,利用一步共装载技术构建药物与基因共载纳米粒,可有效共装载药物与基因,成功递送基因至细胞质内,同时递送药物入核。一步共装载技术可简化基因与抗肿瘤药物共载体系制备工艺,获得的共载体系具有增强的抗肿瘤细胞活性,初步安全性评价结果显示该共载纳米粒安全性好,具有进一步研究开发和临床应用的巨大潜力。随着适配体技术的发展,必将获得更多的适宜装载各种抗肿瘤药物的结合型寡聚核苷酸,因此论文建立的一步共装载技术有广阔的应用前景。