PET塑料降解菌株的筛选鉴定、降解特性评价及关键酶基因分析

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聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate,PET)因其良好的性能,广泛应用于各类商品。然而,又因其难降解特性,成为塑料“白色污染”的主要来源,对自然界、人类生活造成严重的危害。目前PET的主要处理方法集中于焚烧、填埋和化学降解,但这些方法耗时耗力,且污染环境。故而生物法降解PET成为了研究者重点关注的领域。本课题利用生物法对PET进行降解处理,期望为治理“白色污染”提供一定的理论基础。PET塑料制品降解菌株的筛选鉴定、降解特性评价及其关键酶基因分析为本研究的主要内容。为此,取得了主要结果如下:(1)以无锡桃花山垃圾填埋场的PET塑料瓶残骸为菌株来源,成功筛选出两株对PET具有降解作用的菌株:JWG-G1和JWG-G2。经傅里叶红外光谱(FITR)检测发现,JWG-G2对PET表面酯键官能团的破坏程度优于JWG-G1,证实JWG-G2对PET降解能力更优。经鉴定,菌株JWG-G2属于微杆菌(Micbacterium)属的微杆菌石油菌(Micbacterium oleivorans),进一步研究其对PET的降解能力及特性。(2)初步降解结果表明,M.oleivorans JWG-G2能在以PET颗粒和薄膜为唯一碳源的条件下生长,处理5 d后通过高效液相色谱(HPLC)检测到PET颗粒处理液中苯二酸单羟乙酯钠盐(Monohydroxyethyl terephthalate,MHET)1.39 mg·L-1,对苯二甲酸(Terephalic acid,TPA)1.06 mg·L-1,和对苯二甲酸双羟乙酯(Bis(2-hydroxyethyl)terephthalate,BHET)多聚体0.25 mg·L-1,PET薄膜处理液中MHET 1.53 mg·L-1,TPA 1.10 mg·L-1和BHET多聚体0.51 mg·L-1,PET颗粒和薄膜失重率分别为1%和1.25%,使用扫描电子显微镜(SEM)观察到PET颗粒和薄膜的表面较处理前更加粗糙,侵蚀痕迹明显。综合分析发现M.oleivorans JWG-G2对于PET薄膜降解效果优于PET颗粒。(3)M.oleivorans JWG-G2与T.fusca角质酶复配构建菌酶混合体系,协同处理P ET薄膜和BHET多聚体15 h,其协同降解效果均优于单菌,单酶处理之和。以BHET多聚体为底物,菌酶混合体系对其协同降解效率为122-167%。以PET薄膜为底物,加入5 m L(OD600=1.0)M.oleivorans JWG-G2菌悬液与3 mL(酶活力40 U·mL-1)T.fusc a角质酶复配成的菌酶混合体系时,TPA和MHET的生成量最多;以TPA为评价标准,协同降解效率为118%;以MHET为评价标准,协同降解效率为155%;PET薄膜失重率提高1.3倍;SEM观察发现PET表面侵蚀程度最高,表面极其粗糙。(4)利用第二代高通量测序技术,完成M.oleivorans JWG-G2的全基因组测序,结果表明,其基因组全长为3851210 bp,G+C碱基含量为70.71%,N50长度为260398 bp。通过基因测序结果,将基因组上的酯酶,角质酶和脂肪酶序列和已报道的PET降解酶基因建立进化树,通过亲缘关系,数据库注释,代谢通路,结构功能以及前期数据进行综合分析,筛选出潜在的PET降解酶基因,推测由19-8号基因编码的蛋白与长链大分子物质结合,断裂其中的酯键,形成小分子物质,而后由4-138,5-212和6-188号基因编码的蛋白结合并水解小分子物质直至完全降解,不过由于其活性不高,水解能力不强,导致中间体积累过多,也与前期实验结果相符。因此,猜测这4个基因可能为潜在的PET降解酶基因。
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