藻红蛋白的新分析特性研究及应用

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:myyiao123
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藻红蛋白(R-phycoerythrin,R-PE)是一种从海藻中提取出来的天然、无毒、稳定、水溶性的捕光色素蛋白。R-PE具有保守、相对稳定的结构;具有明亮的光致发光、良好的生物相容性和较高的pH稳定性;具有高吸光系数、高荧光量子产率、大的斯托克斯位移等优良的光学性能。这些优异的性能使R-PE在生物分析和生物医学中作为模型蛋白和荧光标记方面具有广阔的应用前景。R-PE与脱氧核糖核酸(DNA)之间具有与生俱来的亲和力,它可以通过非共价静电相互作用、氢键和疏水相互作用与DNA进行非特异性结合,因此,探索R-PE与DNA之间的非共价相互作用,将有助于拓展R-PE作为DNA传感分析工具的应用。然而,据我们所知,R-PE-DNA的非共价相互作用至今鲜有报道。除此以外,R-PE表面含有丰富的氨基酸残基,有研究表明,医用消毒剂中的主要成分邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)与氨基在一定条件下可以发生衍生化反应,衍生产物的荧光强弱变化可以反映OPA浓度的大小。由此,基于R-PE优良的光学性质以及表面含有丰富氨基酸残基的双重特性,本论文构建了一种新型的用于OPA检测的比率型荧光探针。鉴于R-藻红蛋白本身良好的理化性质及独特的光学特性,本论文构建了两种以R-PE为核心的荧光探针,分别用于检测DNA和OPA,具体内容如下:1、本论文基于聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDADMAC)介导的R-藻红蛋白(R-PE)与DNA的非共价相互作用,构建了一种简单、快速检测DNA的荧光生物传感器。在PDADMAC的存在下,R-PE可以有效地吸附在BHQ2标记的单链DNA(BHQ2-ssDNA)上形成稳定的R-PE/ssDNA复合物,通过R-PE与BHQ2之间的荧光共振能量转移(FRET)使R-PE的荧光被显著猝灭。在DNA靶目标出现后,由于刚性双链的形成,BHQ2-ssDNA从R-PE表面释放出来,同时R-PE的荧光也随之恢复。该荧光生物传感器线性检测范围为0.5100 nM,检测限为0.17 nM,灵敏度较高,同时对单碱基识别具有良好的选择性,可用于实际样品的检测;该传感器天然无毒、生物相容性与稳定性良好,同时在测量过程不需要额外的清洗步骤和较长的孵育时间,适合于快速的分析。本方法为DNA分析方法的设计提供了一个新的视角,为核酸检测和分子传感提供了一个前景广泛的平台。2、基于R-藻红蛋白与邻苯二甲醛的衍生化反应,构建了一种新型的检测邻苯二甲醛的荧光比率型探针。R-藻红蛋白经SDS去折叠后将所有的伯氨基团裸露出来,之后在β巯基乙醇存在的碱性环境中,与邻苯二甲醛相互反应可以衍生出一种发蓝色荧光的异吲哚类物质,在该体系中,随着邻苯二甲醛浓度的增加,R-藻红蛋白本身的荧光信号逐渐减弱,衍生出的异吲哚类物质发出的蓝色荧光信号逐渐增强,一强一弱的荧光变化构成了高灵敏的比率型荧光探针。与传统的非比率型荧光探针相比,操作简单,不受光源强度和仪器灵敏度的影响,所以其探针的选择性与灵敏度更高,在5100μg·mL-1的线性范围内,最低检测限为1.7μg·mL-1。根据R-PE探针与OPA反应时溶液产生的颜色变化,本文同时也提供了一种更加简单、快速的利用肉眼来比色检测OPA的方法,这种方法使探针的应用前景更为广泛。
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