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胆固醇是动物组织中的一种含量最丰富的固醇类物质,在机体中行使着多种重要功能。在哺乳动物体内,胆固醇的从头合成是一个以乙酰辅酶A(acetyl-CoA)为原料的多步酶学级联反应。胆固醇平衡主要受到两种反馈调节系统的调控:固醇介导的胆固醇合成限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGCR(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase)的泛素化降解和固醇调节元件结合蛋白 SREBP(sterol-regulatory element-binding protein)的成熟(Goldstein et al.,2006)。Insig(Insulin-induced genes)蛋白是调控HMGCR 降解和 SREBP 成熟的关键蛋白。Insigs蛋白包含有Insig-1和Insig-2,它们是锚定在内质网(endoplasmic reticulum,ER)上的多次跨膜同源蛋白。在固醇介导下,Insigs蛋白分别通过结合两种 ER 蛋白,HMGCR 和 SCAP(SREBP cleavage-activating protein),调控机体内脂质代谢平衡(Gong etal.,2006)。Insigs蛋白通过招募并结合内质网上的泛素连接酶(E3s),如:gp78,RNF145和TRC8,调控固醇介导的胆固醇合成限速酶HMGCR的泛素化-蛋白酶体降解。另外,Insigs蛋白通过结合SCAP/SREBP复合体,抑制SREBP的成熟。Insig-1和Insig-2蛋白的稳定性均受到gp78的调控。其中,在培养的细胞中Insig-1蛋白的半衰期远短于Insig-2。肝脏中gp78的缺失显著性地增加Insig-2蛋白的稳定性(Liu etal.,2012)。Insig-1蛋白的降解调控机制已经研究的比较清楚,而对Insig-2蛋白修饰与稳定性调控机制的研究还不清楚。实验室的前期工作中发现在gp78基因全身敲除小鼠的多个组织中Insig-2的蛋白表达水平均上调,而有趣的是,在小鼠骨骼肌组织中,Insig-2的蛋白水平不受gp78的调控。这一发现提示我们Insig-2蛋白在肌肉组织中可能存在着不一样的调控机制。通过对Insig-2蛋白泛素化位点的筛选发现,第215位半胱氨酸残基(C215)是Insig-2的泛素化位点。从Insig-1和Insig-2蛋白序列比对结果分析发现,相较于Insig-1蛋白,Insig-2蛋白的C端特有一段“YEC215K”序列。同时,利用生物素标记的探针DCP-Bio1鉴定出Insig-2蛋白的C215又是其氧化修饰位点,而Insig-1蛋白不具备这种氧化修饰,提示我们Insig-2蛋白的稳定性可能是受到细胞内氧化还原状态的调控。本论文的研究中,我们揭示了肌肉组织中Insig-2蛋白是通过C215的氧化修饰竞争性地抑制了该位点的泛素化修饰而稳定。进一步,我们发现了小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12分化过程中,细胞内ROS(reactive oxygen species,ROS)水平递增,Insig-2蛋白表达量也随之递增。而且,Insig-2的缺失改变了分化的肌肉细胞内脂肪酸合成相关基因的表达及导致严重的细胞内脂滴堆积。总之,我们的工作目前发现了在特定的氧化环境(如:肌肉)中Insig-2蛋白通过氧化修饰竞争性抑制其泛素化降解,从而稳定表达,参与脂质代谢调控,揭示了细胞内ROS感应的机制及与代谢的联系。