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内蒙古绒山羊是自治区地方优质资源品种,绒毛生产性能是内蒙古绒山羊的重要经济性状。影响绒毛生长的因素有很多,而褪黑激素、miRNA是其中两个非常重要的因素。近年来,关于褪黑激素影响绒山羊绒毛生长的研究发现,持续埋植褪黑素可促进羊绒提前进入生长期,诱发2次生绒并在分子水平改变了很多绒毛生长相关基因的表达,而对于mi RNA这一重要毛发生长调控因子的研究未见详细报道。因此,本研究以mi RNA为介导,通过microRNA靶基因指纹图谱、实时荧光定量PCR、RNA-seq等试验手段,建立外源褪黑激素、miRNA及其靶基因的关系,进一步从分子水平上的解析褪黑激素促进绒毛生长的机理,为提高绒毛产量和品质提供理论依据。主要研究结果如下：1、microRNA靶基因指纹图谱(MTFP)方法的建立建立了一种实验性获得miRNA靶基因的新方法(microRNA Targets Finger Print, MTFP)。该方法在设定上游种子序列的互补序列和下游锚定序列的基础上添加特殊接头,通过反转录和特殊二步PCR将microRNA的靶基因扩增；扩增后的microRNA靶基因在聚丙烯酰胺凝胶电泳中检测其片段大小和表达丰度,用于筛选在不同生理状态或试验条件下特异表达的基因；特定的靶基因序列通过DNA回收和测序方法得到。以miR-203为例,在不同生理状态的山羊皮肤样品中获得了5条大小分别为718bp(JN709494)、349bp(JN709495)、243bp(JN709496)、156bp(JN709497)和97bp(JN709498)的靶基因序列。其中JN709494, JN709497, JN709498分别为MBNL1、ZKSCAN1、SLC7A6OS的同源基因。MTFP经济适用、可操作性强,可用于探索microRNA调节的靶基因,或用来评估靶基因的表达谱特征。2、褪黑激素影响miRNA及其靶基因的研究埋植褪黑激素明显改变了6个绒毛相关miRNA的表达规律。一个绒毛周期内,除let-7外,miRNA的表达量发生三次跃迁。对照组中miR-203、miR-205、let-7、miR-96、miR-183均是8、9月份以较低水平基本保持不变,10月开始上升,11月达到全年的最高水平后急剧下降,并于2月、6月又出现两个小的表达高峰；miR-205表达规律与其余5个miRNA基本一致,一个绒毛周期内也出现3个表达高峰,全年表达量最高值出现在12月。埋植组中miR-203、miR-205出现3个明显的表达高峰,分别是10月、12月、2月,miR-203全年表达最高值出现在10月,miR-205则位于2月；miR-96、miR-199a全年内在10月、12月、2月虽然也出现了三个峰值,但除了10月达到全年最高水平外,其余两个峰值波动不明显；miR-183埋植褪黑激素后全年处于较低水平。埋植褪黑激素改变了miRNA之间的共表达模式。对照组各miRNA之间相关系数范围为0.87-0.99,均大于0.85,与对照组相比,埋植组中let-7a与miR-96、miR-199a、 miR-205,miR-203与miR-96、miR-199a, miR-96与miR-183, miR-183与miR-199a之间的相似性被明显消弱。MTFP并未检测到埋植前后特异条带的分布,但定性的分析了候选miRNA的靶基因。3、埋植组与对照组10月皮肤组织转录组文库构建及测序分析在构建内蒙古绒山羊10月皮肤埋植组与对照组转录组文库的基础上进行了illumina高通量测序,共获得8千多万条100bp的reads,从头组装得到了60,565条contigs, contigs的平均长度为656bp,N50为860bp,最长的contigs为19,346bp。大于300bp的contigs52,331条。通过CLCgenomicWorkbench6.0的RNAseq分析筛选到fold_change(MT-10/C-10>4、Q-value<0.001或fold_change<MT-10/C-10<-4、Q-value<0.001的差异contigs465条,其中393条contigs序列显著上调,72条contigs序列显著下调,420条contigs在NR数据库具有注释信息。对这些差异基因进行GO分类和KEGG通路分析,上调基因富集到发育相关的16条通路,包括黏着斑连接、细胞外基质-受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架调控、TGF-β信号通路、Wnt信号通路等16个pathways。下调基因未发现显著性富集通路。4、褪黑激素介导miRNA候选靶基因的研究为了进一步研究褪黑激素、miRNA及其靶基因的关系。本研究首先基于10月转录组contigs数据,利用miranda3.0软件预测得到7个miRNA介导调控16750条contigs序列。通过埋植组与对照组RPKM值比较筛选到Q value<0.05且|Fold_change|≥2的contigs912条。结合本研究实验获得的miRNA靶基因数据,确定miR-203及靶基因DOST, let-7a及靶基因LYPLA1、ND4, miR-183及靶基因GLG1, miR-199a及靶基因KRTAP5.6. RPL30、MYH9、MYL6为影响绒毛生长的候选miRNA与靶基因。