人腺病毒41型(Adenovirus type41, Ad41)与人腺病毒40型构成了腺病毒F组,F组腺病毒是十分重要的致病病原体,主要导致婴幼儿腹泻,约占非细菌性腹泻的5%-15%,仅次于轮状病毒。F组腺病毒具有一下几个特点。第一,该组病毒在体外难于培养传代,即应用常规培养传代其他腺病毒的方法,不容易将F组腺病毒连续传代培养,因此又被称为难养腺病毒(fastidious adenoviruses)第二、F组腺病毒具有肠道嗜性,该组病毒能够经受胃酸、胆汁、消化酶等作用而不失活。因为F组腺病毒具有肠道嗜性的特性,所以其具有改造为消化道靶向载体的潜能,因此成为研究的热点。第三、在病毒结构方面,F组腺病毒是目前发现的人类腺病毒中唯一具有长、短两种纤维突的腺病毒,而其它人类腺病毒仅有一种纤维突,其中长纤维突的重要功能之一是通过与CAR (Coxsackie and Adenovirus Receptor, CAR)结合,介导病毒进入细胞,短纤维突的受体及功能至今不明。本课题组己成功建立了能够进行Ad41连续培养传代的细胞系293TE7.6,从而为Ad41研究提供了有利基础。本文研究内容包括以下两点：一、Ad41病毒颗粒长、短两种纤维突比例的研究。通过原核表达、纯化Ad41短纤维突蛋白(sFiber-P)及长纤维突蛋白(1Fiber-P),以定量的sFiber-P,1Fiber-P作为标准。通过Western blot检测纯化Ad41的短、长纤维突蛋白条带,通过图像分析软件Gel-pro analyzer4.0对sFiber-P,1Fiber-P条带及Ad41的短、长纤维突蛋白条带进行定量。结果表明Ad41的短、长纤维突蛋白的比例为5：1。为验证上述结果,我们构建了短纤维突缺失的重组腺病毒Ad41DSF-GFP。研究结果表明,Ad41DSF-GFP的短纤维突的量为Ad41长纤维突的6倍,从而进一步确证了Ad41的短、长纤维突蛋白的比例为5：1。荧光定量PCR结果表明,细胞内Ad41短纤维突蛋白与长纤维突蛋白mRNA水平无明显差异,Western blot结果表明, Ad41感染的细胞内长纤维突蛋白量低于短纤维突蛋白量。上述结果表明,Ad41病毒上短纤维突与长纤维突数量不相等由转录后水平差异导致的。对短纤维突的功能研究表明,Ad41-GFP感染效率为Ad41DSF-GFP的1.2-1.8倍,Ad41DSF-GFP的VP/IU值为Ad41-GFP的1.5倍,Ad41-GFP进入细胞的速度也快于Ad41DSF-GFP。匕述结果表明,Ad41短纤维突具有辅助病毒进入细胞的功能。二、Ad41形态发生学研究对Ad41的形态发生过程研究主要获得以下结果：病毒进入细胞的方式：Ad41通过非网格蛋白介导的入胞、网格蛋白介导的入胞及直接进入细胞三种方式进入胞内,其中以非网格蛋白介导的入胞方式为主,在病毒进入细胞的过程中细胞的微绒毛也发挥一定的作用。病毒在细胞内的转运：病毒进入细胞后以以下三种方式向细胞核方向运动：包裹在囊泡内、在溶酶体中以及以游离形式转运。病毒到达细胞核附近,病毒核衣壳内成分通过细胞核孔进入细胞核。病毒在细胞内的复制：子代病毒颗粒首先出现在细胞核内,子代病毒数量由少到多,排列方式由散在到大量病毒聚集或呈结晶状排列。随着时间的推移,子代病毒出现在细胞浆内,细胞浆内的病毒颗粒也可以散在排列、聚集成团或呈结晶状排列。病毒在复制过程中可以诱导产生两种包涵体,即纤维丝状包涵体与致密包涵体,对包涵体进行免疫胶体金标记显示,两种包涵体均含有Ad41组分。其中纤维丝状包涵体内含有短、长纤维突蛋白成分。病毒的释放：随着时间的增加,细胞核内或细胞浆内病毒大量聚集或呈结晶状排列,细胞核核膜界限模糊不清或消失,细胞质膜破裂,病毒从细胞质膜破裂处脱离细胞完成释放过程,即病毒以裂细胞方式释放。子代病毒的再感染：从细胞内释放的子代Ad41吸附于其他细胞的表面,进入细胞后继续进行下一代病毒的复制过程。对Ad41的形态发生研究结果表明,Ad41形态发生过程与其他腺病毒没有明显区别,与Ad5相比Ad41产生的纤维丝状包涵体有别于Ad5产生的包涵体形态。综上所述,本研究确定了Ad41短、长纤维突比例为5：1,初步证明Ad41短纤维突具有辅助病毒感染细胞的作用。上述结果为Ad41的结构与功能研究提供了信息。本文还研究了Ad41的的吸附、入胞、复制、释放等形态发生过程,并确定Ad41诱导产生的包涵体中含有Ad41成分,上述研究结果为Ad41的形态发生学提供了依据。