淇河鲫CYP19基因的克隆、表达模式分析及免疫组化定位

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与高等脊推动物相比,鱼类的性腺在胚胎发育早期更明显地表现为双向分化潜能,各种外部环境因素都可能在不同程度上影响鱼类的性别分化。目前内源性类固醇激素在鱼类性腺分化中的重要作用已被普遍认同,芳香化酶作为鱼类体内雌激素生物合成的关键酶和限速酶,该酶基因(CYP19)的表达与调控显然在鱼类性别决定与分化的分子机制中起着重要的作用。 淇河鲫是产于豫北淇河的中国地方性银鲫种群,具有天然的三倍染色体系统和雌核发育繁殖方式,自然群体中存在着极少数的雄性个体,且雄性个体具有正常的生精能力。因此,淇河鲫是典型的雌核发育两性型种群。本研究通过对淇河鲫的性激素代谢基因——芳香化酶基因的克隆、时空表达与性腺细胞学定位的研究,从分子和细胞水平上探讨了这一雌核发育两性型种群性别分化的机制。 利用RT-PCR和3′-RACE技术,在淇河鲫卵巢和脑中分别克隆得到两种不同类型CYP19 cDNA序列片段,其中CYP19a cDNA克隆片段长1468bp,含有240bp 3′-非翻译区,编码409个氨基酸残基;CYP19b cDNA克隆片段长2671bp,含有1385bp 3′-UTR,编码428个氨基酸残基;两种CYP19 cDNA序列之间同源性为64.65%,氨基酸序列同源性为62.88%。系统进化显示,淇河鲫CYP19氨基酸序列分属于鱼类卵巢和脑芳香化酶基因的分支,与金鱼的同源性最高。 以β-actin为内参照,采用半定量RT-PCR方法检测两种CYP19基因在淇河鲫成体周年发育过程的三个时期(繁殖期、性腺退化期、越冬期)五种组织(精巢、卵巢、脑、肾、肝)中的表达模式以及在胚胎发育过程七个阶段(囊胚期、原肠胚、神经胚、尾芽期、肌肉效应期、孵出期、卵黄吸收期)的表达。结果显示,两种CYP19基因的表达模式有所不同。在繁殖期的各组织中CYP19均有表达,且表达活性卵巢≈脑>肝>精巢>肾;性腺退化期的肝、肾中均未见表达,其余三个组织的表达活性卵巢>脑>精巢;越冬期也仅在三个组织中有表达,表达活性精巢>卵巢>肝。CYP19b在繁殖期的表达活性最高,除了肾其余四个组织中均有表达,且表达活性脑>卵巢>肝>精巢:性腺退化期与越冬期则仅见脑中有高表达。但总的来看,CYP19a主要表达于性腺组织(精巢和卵巢)中,CYP19b则主要表达于脑组织中。CYP19a从胚胎尾芽期出现,后呈递增表达;CYP19b基因则至卵黄吸收期有突然的强表达。 SABC法对周年发育不同阶段卵巢和精巢进行的芳香化酶免疫细胞定位显示,芳香化酶在卵巢的滤泡细胞、卵被膜、胞质、核膜以及精巢的生殖细胞、间质细胞和足细胞中均有分布,与半定量RT-PCR结果相互印证。
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