野生黑斑蛙皮肤抗菌多肽的分离纯化及活性研究

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抗菌多肽(antimicrobial peptides, AMPs)是多种生物体经外界环境诱导由特定基因编码,核糖体合成并由一些腺体分泌的参与到生物体固有免疫反应的小分子多肽。其原指存在于昆虫血淋巴当中的一种具有广谱抗菌作用的多肽,是由瑞典科学家Boman于1980年在天蚕蛹中首次分离得到,而后相继在动物体、人体内、植物体中甚至是细菌当中发现类似功能结构的抗菌多肽类。现今,抗菌多肽的定义已经不仅仅局限于广谱的抗菌活性,而有些抗菌多肽对于部分真菌、寄生虫、病毒及肿瘤细胞等也具备强力杀伤作用,甚至有些抗菌多肽对于HIV-1病毒的增殖具有抑制作用,最值得注意的是,其针对多重耐药菌株也表现出优异的杀灭作用。毋庸置疑,传统抗生素的发现及应用是伟大的且具有拯救意义的。至20世纪80年代,人们借助抗生素这把利刃几乎征服了所有的感染类疾病,然而,由于病原微生物的特殊结构及抗生素的使用不当,耐药菌株越来越多。抗菌多肽的发现就像是为新型抗菌药物的研制注入了一股新鲜血液,尤其是某些抗菌多肽对耐药菌及肿瘤细胞表现出强力杀伤作用,但对于正常细胞没有任何作用,因此,抗菌多肽无疑成为最有希望替代抗生素成为新一代抗菌药物的小分子药物。近些年,抗菌多肽类药物的化学实体数量正在逐年上涨,最具有代表性的抗菌多肽药物为Enfuvirtide,其能阻碍HIV病毒进驻到细胞内部。可见,抗菌多肽具备的研究潜力和带来的经济价值是无法估计的,且其势必为人类的生命健康造福。两栖类动物作为水生鱼类与陆生爬行类之间的过度种群,其生存环境变化差异较大,且其皮肽裸露在外,没有甲壳等的保护,这就给病原微生物的滋生提供了相当有利环境条件,但是两栖类动物却能抵御病原微生物的感染入侵,有研究表明两栖类动物其后天获得性免疫十分脆弱,而在其机体防御系统中起主导的往往都是其先天具备的物理屏障及抗菌多肽防御系统。而两栖类中无尾目蛙类的皮肤富含各种腺体,尤其是颗粒腺体,所以能够分泌的抗菌多肽种类也是较其他两栖类多的,且蛙类种族庞大,几乎遍布世界各地,这就意味着无尾目蛙类体内蕴含的天然抗菌多肽数量是十分可观的,更有研究证实,两栖类动物皮肤内蕴含的活性肽含量相当于高级哺乳动物体内的10万多倍。本研究以野外捕获的黑斑蛙(Rana nigromaculata)为试验材料,通过电击黑斑蛙背部皮肤,人为使其应激以使蛙皮中的腺体分泌出具有抗菌活性的分泌液,再通过高效液相色谱对处理后的分泌液进行纯化,多次纯化后,便可获得纯度较高的天然黑斑蛙皮肤抗菌多肽,利用多肽测序仪对其进行Edman降解测序后得到两种新型蛙类抗菌多肽AMP-1和AMP-2,经过活性测定,发现其对于金黄色葡萄球菌(ATCC25923)及大肠杆菌(ATCC25922)均有强力抑制作用,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等菌亦有抑制作用,除此之外,其对于MCF-7癌细胞同样表现出杀伤作用,而在兔溶血细胞试验中表现出轻微的溶血作用。
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