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目的:了解儿童急性单核细胞白血病(AML-M5)患者中编码组蛋白修饰酶基因的表达谱,为进一步研究组蛋白修饰在儿童AML-M5的发生、发展中的作用提供实验基础。组蛋白乙酰化是组蛋白修饰研究的重要部分,本研究探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)LBH589对白血病细胞的作用及其对编码组蛋白修饰酶基因的表达谱的影响,为儿童AML-M5的个体化治疗提供初步的理论基础。方法:1.采用定量PCR芯片技术,对27例儿童AML-M5患者及20例对照组的88种基因的mRNA的表达水平进行测定,其中包含NADPH在内的3个内参基因及85个编码组蛋白修饰酶的基因;然后进行分层聚类分析;部分基因采用Western-blot方法验证其蛋白水平的表达。2.CCK-8法检测LBH589对HL-60细胞、SHI-1细胞增殖能力的影响,计算其IC50值。3.氯化硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验检测LBH589对HL-60细胞的诱导分化能力。4.流式细胞仪检测LBH589对HL-60细胞、SHI-1细胞周期的影响。5.流式细胞仪检测LBH589对HL-60细胞、SHI-1细胞凋亡的影响。6.定量PCR芯片技术测定LBH589作用HL-60细胞、SHI-1细胞前后其编码组蛋白修饰酶基因表达水平的差异。7.Western-blot测定LBH589作用HL-60细胞、SHI-1细胞后AURKA、NSD1、PCAF三种蛋白表达的差异。8.CCK-8法检测LBH589对儿童AML-M5患者原代细胞增殖能力的影响;Western-blot测定LBH589作用儿童AML-M5患者原代细胞后AURKA、NSD1、PCAF三种蛋白表达的差异。结果:1.定量PCR芯片技术发现儿童AML-M5患者中28个基因的表达存在显著差异,其中15个基因明显上调,分别为:GCN5L2、SETD8、KDM5C、NCOA1、RNF2、AURKA、DNMT1、AURKB、KDM1A、EHMT2、EZH2、DNMT3A、PAK1、HDAC2、WHSC1;13个基因明显下调,分别为:HDAC6、HDAC7、UBE2B、HDAC5、PRMT3、PRMT8、EED、RPS6KA3、EP300、CDYL、NOTCH2、RPS6KA5、HDAC10;通过分层聚类分析,对28个基因表达成功聚类;Western-blot方法发现儿童AML-M5患者中GCN5L2的蛋白水平的表达明显高于对照组,而儿童AML-M5患者中HDAC7的蛋白水平的表达明显低于对照组。2.不同时间、不同浓度的LBH589影响HL-60细胞、SHI-1细胞的增殖作用不同,随着作用时间的延长、浓度的增加,LBH589对白血病细胞的抑制作用随之增强。24小时、48小时、72小时LBH589对HL-60细胞的半抑制浓度分别为55.55nmol/L、47.41nmol/L、30.44nmol/L,而24小时、48小时、72小时LBH589对SHI-1细胞的半抑制浓度分别为75.24nmol/L、64.56nmol/L、54.68nmol/L。3.LBH589对HL-60细胞的诱导分化率与未加药组无明显区别,而明显低于维甲酸诱导组。4.LBH589作用HL-60细胞、SHI-1细胞后,使两种细胞处于G0/G1期的细胞明显增多,而处于S期细胞明显减少,阻滞白血病细胞的增殖。5.25nmol/L的LBH589处理的HL-60细胞、SHI-1细胞24小时后细胞凋亡率明显高于对照组。6.定量PCR芯片技术,对细胞内85个编码组蛋白修饰酶的基因表达水平进行测定发现:LBH589处理的HL-60细胞中有30个基因表达较对照组明显下调、3个基因表达量明显上调;而LBH589处理的SHI-1细胞中有6个基因表达较对照组明显下调、8个基因表达量明显上调;两种细胞共同表达下调的基因有6个,分别为:KAT6B、SETD7、SUV39H1、AURKA、NSD1、PCAF;共同表达上调的基因有3个,分别为:HDAC11、DZIP3、CIITA。7.Western-blot方法证实50nmol/L的LBH589作用HL-60细胞、SHI-1细胞48小时及72小时后,细胞内AURKA、PCAF、NSD1的蛋白水平表达明显下降。8.LBH589对3例儿童AML-M5患者原代细胞作用24小时的半抑制浓度分别为93.32nmol/L、92.591nmol/L、36.71nmol/L;LBH589作用白血病原代细胞后组蛋白修饰酶AURKA、PCAF、NSD1蛋白表达呈下降趋势。结论1.本研究采用高通量、快速的定量PCR芯片技术对儿童AML-M5患者初诊骨髓单个核细胞中编码组蛋白修饰相关的85个基因的表达水平进行检测,有效地筛选出差异表达的基因;这些基因中有的基因与AML的相关性已被证实,有的基因如GCN5L2等与AML的关系为首次发现,为研究儿童AML-M5的发生机理提供了新的思路。2.LBH589具有抑制HL-60细胞、SHI-1细胞及儿童AML-M5白血病原代细胞增殖的作用,但其诱导HL-60细胞分化的作用不明显;LBH589对HL-60细胞、SHI-1细胞的细胞周期影响明显,阻滞了白血病细胞的增殖;LBH589能诱导HL-60细胞、SHI-1细胞的凋亡。3.LBH589能改变白血病细胞内多种组蛋白修饰酶的表达,提示各种组蛋白修饰之间存在相互的作用和影响;其中,AURKA、NSD1、PCAF的表达明显下调;这些基因在白血病的发生、发展和预后中具有重要意义;为进一步研究LBH589在儿童AML中的作用机理开拓了新的思路;也为临床儿童AML的个体化治疗奠定了一定的理论基础。