论文部分内容阅读
1.猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIVA毒力基因的克隆和表达。参照GenBank中的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae.APP)溶血素(Apx)IVA基因序列设计了一对特异性引物，PCR扩增到992bp的目的片段，将其插入pMD-18T载体中，并将连接产物转化入BL21中，转化菌入含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12～16h，挑选白色菌落培养，提取质粒，经PCR和酶切鉴定，将鉴定正确的质粒测序。用EcoRⅠ和HindⅢ从克隆载体中切下目的片段，冻溶法回收酶切片段，在T4DNA连接酶的作用下重组入经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的表达载体pET-28a中，转化到BL21(DE3)，挑取白色菌落培养，经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE鉴定，目的基因获得高效表达。
2.猪胸膜肺炎放线杆菌和猪巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立。依据GenBank中的胸膜肺炎放线杆菌的溶血素IVA基因和巴氏杆菌的16SRNA基因设计合成了2对引物，对每个细菌PCR条件进行优化后，将两个菌进行双重PCR反应，产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见胸膜肺炎放线杆菌473bp的片段和巴氏杆菌的253bp的片段；将两个菌与金黄色葡萄球菌，肺炎双球菌，大肠杆菌，支气管败血波氏杆菌做模板进行PCR反应，其他菌不能扩增出相同的特异片段，表明应用双重PCR方法可高效和特异的检测猪胸膜肺炎放线杆菌和猪巴氏杆菌。