论文部分内容阅读
结肠腺瘤息肉蛋白(Adenomatous polyposis coli, APC)是一个肿瘤抑制因子,其突变与家族性结肠腺瘤息肉病(Familial adenomatous polyposis, FAP)的发生有关。纤毛是突出于细胞表面主要由微管构成的亚细胞结构。纤毛在机体内具有重要的生物学功能,可以调节细胞运动,参与多种信号通路等。纤毛结构和功能的异常会导致许多纤毛相关疾病的发生。在FAP中一些表现突出的肠外症状,例如纤维瘤、骨瘤、视网膜色素上皮肥大等疾病都是纤毛相关性疾病,这暗示APC突变与纤毛异常之间存在必然联系。APC-N是APC中高度保守的一个片段,在许多发生APC突变的个体中都会保留该片段。本课题主要对APC-N片段影响纤毛生长的机制进行研究,研究内容包括以下三部分：第一部分：APC-N片段过表达对MDCK细胞纤毛生长的影响。首先我们将质粒pEGFP-C3和重组质粒pEGFP-C3-APC-N转染入MDCK细胞中,继续培养3天诱导形成纤毛,western印迹和免疫荧光染色结果显示,APC-N片段在MDCK细胞中成功表达且主要定位在细胞质。进一步我们用抗acetylated tubulin鼠单克隆抗体标记细胞内的纤毛,免疫荧光染色后观察并统计细胞纤毛生长率,结果表明,在MDCK细胞中,过表达APC-N明显抑制纤毛的形成。第二部分：APC-N片段过表达对pericentrin定位、细胞周期进展及acetylated tubulin表达的影响。在第一部分实验中我们发现APC-N片段过表达抑制纤毛的形成,本部分将从以下几方面来探讨其抑制纤毛形成的机制：1,APC-N过表达对基体组成蛋白pericentrin定位的影响；2, APC-N过表达对细胞周期进展的影响；3, APC-N过表达对HDAC6和acetylated tubulin表达的影响。免疫荧光染色和western印迹结果表明,APC-N片段不是通过影响pericentrin在纤毛基体的定位以及扰乱细胞周期进程来抑制纤毛的形成。但细胞中acetylated tubulin的水平明显降低,而HDAC6的表达是上调的,这表明APC-N通过上调HDAC6进而降低acetylated tubulin的水平来抑制纤毛的形成。第三部分：APC-N片段通过β-catenin/PI3K/AKT/GSK-3β正反馈环调节对纤毛生长的抑制。为了进一步研究APC-N片段抑制纤毛形成的机制,我们运用western印迹检测β-catenin和GSK3β的表达,结果显示,APC-N过表达导致β-catenin表达升高,且GSK3β活性受到抑制。我们分别利用RNA干扰技术和GSK3β抑制剂SB216763敲减β-catenin和抑制GSK3β活性,结果表明,敲减β-catenin导致纤毛生长率提高,而GSK3β抑制剂SB216763处理进一步降低了纤毛生长率。这表明β-catenin和GSK-3β参与调节APC-N导致的纤毛损伤。为了进一步研究二者之间的潜在调节机制,我们检测了GSK3β的上游调节信号分子AKT。研究发现APC-N过表达后,P-AKT(T3O8)水平升高,这表明PI3K/AKT信号通路被激活。我们进一步加入P13K抑制剂和干扰P-catenin来检测PI3K/AKT信号通路与β-catenin和GSK3β的关系,结果表明,抑制剂LY294002处理后,β-catenin和P-GSK-3β (Ser9)的水平降低。同时,纤毛生长率明显提高；干扰P-catenin后,细胞中P-AKT(Thr308)的水平降低。这些结果表明一个正反馈环β-catenin/PI3K/AKT/GSK-3β调节P-catenin和GSK-3β之间的相互作用。此外,为了分析PI3K/AKT信号通路是否直接参与APC-N诱导的纤毛损伤,我们同时用P13K和GSK3β的抑制剂处理细胞检测其对细胞纤毛的生长影响,结果表明两种抑制剂处理只降低了P-AKT (T308)的水平,而并不影响GSK-3β, β-catenin和纤毛生长率。这些结果表明PI3K/AKT信号通路并不直接影响APC-N诱导的纤毛损伤,其主要通过P-catenin和GSK-3β间接作用来影响纤毛。综上所述,APC-N过表达抑制MDCK细胞纤毛的形成。其作用机制不是通过影响pericentrin在纤毛基体的定位以及扰乱细胞周期进程来抑制纤毛的形成。APC-N通过影响微管蛋白的乙酰化抑制纤毛的形成。此外,β-catenin/PI3K/AKT/GSK-3p正反馈环也参与APC-N诱导的纤毛损伤。.