论文部分内容阅读
目的:检测miR-503在食管鳞癌组织标本及食管鳞癌患者血清中的表达情况,分析miR-503与食管鳞癌病理特征的相关性;探索miR-503在食管鳞癌细胞Eca109、Eca9706中的生物学功能的影响及其作用机制。方法:1、收集2014年3月至2014年9月在四川医科大学附属医院胸心外科手术切除的新鲜食管鳞癌及癌旁组织40例;2、采用Taqman探针法分析miR-503在癌组织、癌旁组织的表达情况;3、依据miR-503表达水平,运用t检验分析及单因素方差分析其与食管鳞癌患者的性别、年龄、肿瘤分化程度、T分期及有无淋巴结转移之间的相关性;4、体外合成 miR-503 mimics 和 miR-503 inhibitor,用 miRNA 转染人食管鳞癌细胞株Eca109、Eca9706;5、采用Taqman探针法检测食管鳞癌细胞中miR-503表达水平变化;6、通过CCK-8试剂盒检测Eca109、Eca9706细胞增殖能力的改变;7、Transwell侵袭实验法检测miR-503对食管鳞癌细胞株Eca109、Eca9706细胞的侵袭、迁移能力;8、利用流式细胞术分析miR-503对食管鳞癌细胞株Eca109、Eca9706细胞周期的影响;9、采用 Western Blot 方法检测 Vimentin、E-cadherin、CyclinD1、CyclinE1蛋白在转染miR-503mimics和NC组Eca109中的表达水平。10、统计学分析:所有实验数据均使用SPSS 17.0统计软件包,所有数据用均数±标准差表示,组间差异的比较使用独立样本均数t检验,多组样本的均数比较采用单因素方差分析,以α=0.05为标准。结果:1、Taqman探针法结果显示,40例食管鳞癌组织中的miR-503的表达水平(6.69±1.04)显著高于癌旁组织(1);2、通过t检验分析发现食管鳞癌组织中miR-503的表达水平与有无淋巴结转移、食管鳞癌分化程度及T分期呈负相关(P<0.05),与患者的年龄、性别和肿瘤大小无相关性(P>0.05);3、Taqman探针法结果显示:与空白对照组相比,mimics组mi R-503的表达水平(180.33士3.13)显著上调(P<0.01);与空白对照组相比,inhibitor组的miR-503的相对表达水平(0.46±0.02)显著下调(P<0.01),表明转染效率较好,符合后续试验要求。4、CCK-8实验结果显示,在48 h、72 h时Eca109及Eca9706细胞的miR-503 mimics组OD值明显少于NC组及control组细胞(P<0.05),miR-503 inhibitor组OD值明显高于NC组及control组细胞(P<0.05)。这表明miR-503能抑制食管鳞癌细胞株Eca109、Eca9706细胞的增殖。5、Transwell实验结果:在迁移实验中,Eca9706细胞,miR-503 mimics组细胞数与NC组比较显著减低(P<0.05),inhibitor组细胞数与N C组比较显著升高(P<0.05),Eca109细胞也呈同样的趋势(P<0.05),这表明miR-503有抑制食管鳞癌细胞株的迁移能力。在侵袭实验中,Eca9706细胞,miR-503 mimics组细胞数与NC组比较显著减低(P<0.05),inhi bitor组细胞数与NC组比较显著升高(P<0.05),Eca109细胞也呈同样的趋势(P<0.05),这表明miR-503有抑制食管鳞癌细胞株的侵袭能力。6、流式细胞检测结果显示,Eca109中miR-503 mimics组G0/G 1细胞比例增加至68.41±1.04%,S细胞比例降低至23.59士 1.58%,与对照组比较差异具有显著性(P<0.05),而G2/M期细胞比例没有明显变化;miR-503 inhibitor组G0/G1细胞比例降低至44.61 士 1.15%,S细胞比例增高至47.39±1.32%,与对照组比较差异具有显著性(P<0.05),而G2/M期细胞比例没有明显变化;在Eca9706细胞中也呈现同样的结果趋势,表明miR-503具有将食管鳞癌细胞Eca109、Eca9706阻滞在G1期的功能。7、Western Blot 结果表明:在 Eca109 中转染 miR-503mimics 组细胞相对于NC组Vimentin表达降低,E-cadherin表达升高,Cycli nD1和CyclinE1蛋白的表达水平降低。这表明:miR-503能通过促进E-cadherin的表达及抑制Vimentin表达来调控食管鳞癌细胞株E ca109的侵袭和转移,能通过抑制CyclinD1、CyclinE1的表达调节食管鳞癌细胞株Eca109的细胞增殖。结论:1、miR-503在食管鳞癌组织高表达,在癌旁组织中低表达;食管鳞癌组织中miR-503的表达水平与有无淋巴结转移、食管鳞癌分化程度及T分期呈负相关,与患者的年龄、性别和肿瘤大小无相关性;2、上调食管鳞癌细胞株Eca109、Eca9706中miR-503表达能抑制食管鳞癌细胞株Eca109、Eca9706细胞的生长和侵袭,并促进其凋亡,下调食管鳞癌Eca109、Eca9706细胞中miR-503表达能促进食管鳞癌细胞株Eca109、Eca9706细胞的生长和侵袭;