蛋白激酶是一类重要的酶,调控大量的细胞过程包括细胞周期的前进、转录、复制以及代谢。根据其结构分类,蛋白激酶分为典型蛋白激酶和非典型蛋白激酶。RIO激酶家族属于非典型蛋白激酶。该家族有三个成员RIO1、RI02和RI03,是近年来发现的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白家族。RI01、RI02激酶存在于从古细菌到人类的组织中,且具有组织特异性,这表明RIO激酶在细胞中具有最基本的作用。对酵母RIO1、RI02蛋白激酶的研究表明：RI01、RI02激酶在核糖体生物学中有重要作用,是细胞进入S2细胞周期及完成有丝分裂的必要因素。人类肿瘤组织中RIO1mRNA与邻近的正常组织相比,过量表达,且呈现出不同的组织分布。人类RI02是40S核糖体亚基前体成熟的必需因子,也是polo样蛋白激酶的受体蛋白,介导细胞有丝分裂。人类RI03蛋白仅存在于多细胞生物的细胞质中,不影响细胞周期,能够抑制C ASP10激活NF κB通路的活性。人类RI03基因的上调,促进了胰腺癌细胞的增殖与扩散。在营自由生活的线虫—秀丽新杆线虫(Caenorhabditis elegans)的研究中,高通量RNAi筛选实验表明：RIO1及RI02的敲除影响幼虫的发育,导致幼虫停止发育、幼虫死亡以及胚胎死亡,暗示了这个基因是控制线虫发育的决定因素之一。尽管这个基因如此重要,到目前为止,在寄生性线虫中,仅有透明毛圆线虫RIO1及捻转血矛线虫RIO1、RI02、RI03的基因结构报道,无任何其它寄生线虫相关功能的报道。为此,本课题主要从以下几个方面进行了研究：1)粪类圆线虫RI03基因的cDNA、gDNA.启动子序列分析通过RACE技术获得粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)RI03蛋白激酶的全长cDNA序列,全长1765bp,预测ORF序列长1521bp,编码506个氨基酸,其中5’-UTR为179bp,3’-UTR为65bp。用生物信息学对Ss-RIO3-cDNA的序列进行了分析,发现它与其它物种该基因氨基酸序列的同源性在22.5%-37.4%之间,且含有RIO激酶的保守功能区域。用邻接法构建RI03氨基酸进化树,选择了19个物种做参考,其中包括6个种类的线虫,6种线虫分支形成—簇,其中包括粪类圆线虫。通过长PCR技术获得了粪类圆线虫RI03的gDNA序列,经与cDNA序列比对分析发现RI03基因没有内含子。而其它两个线虫(捻转血矛线虫、秀丽新杆线虫)该基因均含有内含子,说明粪类圆线虫的该基因具有其特异性。通过Genome Walking技术获得RI03基因的启动子序列,长为600bp。启动子元件分子表明：RI03启动子序列含有4个TATAbox(TATAWAW),4个GATAmotif(WGATAR),2个Inverse GATA(TTATC)。2)RI03基因在粪类圆线虫各发育阶段的转录水平通过反转录PCR (RT-PCR)技术,研究各阶段(寄生性成虫pAD,寄生性一期幼虫ppL1,自由生活的一期幼虫pfL1,自由生活的三期幼虫iL3,自由生活的成虫FAD)虫体该基因的转录水平。研究结果表明：该基因在各发育阶段都有转录,其中感染期三期幼虫和自由生活的成虫转录水平较高。3)体外原核表达粪类圆线虫RIO3激酶蛋白并检测其激酶活性构建原核表达载体,体外微量表达了该蛋白。截取RIO3cDNA序列从499bp到1419bp的片段,体外原核表达了该截短序列。进一步酶活检测实验发现该表达截短蛋白不能自磷酸化及磷酸化MBP蛋白,说明该截短蛋白不具有自磷酸化活性及磷酸化MBP蛋白的功能,有待进一步研究。4)粪类圆线虫RI03基因启动子在虫体中的定位研究构建绿荧光表达载体S s-promoter-PAJ02,通过性腺显微注射技术导入自由生活的雌虫性腺中,观察自由生活的雌虫、虫卵、L1期幼虫中该基因在虫体中的空间表达形式,结果未发现该基因在虫体中表达。本研究获得了Ss-RIO3蛋白激酶的cDNA, gDNA及启动子的DNA序列并对其结构特征进行了分析,发现该基因在该虫各发育阶段都有转录。此外,原核表达了该截短基因,并初步检测到其不具有激酶活性；并构建了荧光表达质粒。这些研究结果为进一步研究该基因的结构与功能奠定了坚实的基础。