一.研究背景支气管哮喘(bronchial asthma,简称哮喘)是全球最常见的慢性疾病之一,它是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病,病理镜下可见支气管周围和肺泡间隔有中性粒细胞、浆细胞、单核细胞和大量嗜酸粒细胞浸润,慢性气道炎症被认为是哮喘的本质。支气管哮喘的气道炎症使人体对各种激发因子的反应性增高,产生气道缩窄和可逆性气流受限,出现咳嗽,气急和喘息等症状,严重地影响着患者的工作和生活,因此,减轻气道炎症及减少细胞浸润成为治疗哮喘的重要措施。糖皮质激素(Glucocorticoid, GC)是目前抑制哮喘气道炎症作用最强的药物,因为它对炎症介质、炎症细胞和炎症反应具有多途径的抑制作用。然而,关于哮喘炎细胞浸润的机制尚不明确,因此探讨哮喘细胞浸润的发病机制、寻找新的治疗及药物靶点是备受关注的重大课题。随着研究的不断发展,关于哮喘发病的假说不断增多,现在有越来越多的证据表明菌群失调与过敏或哮喘有密切联系。许多流行病学研究发现肥胖与哮喘的发生发展有重大关系。在既往一项流行病学研究中发现,发展为哮喘的儿童与正常儿童在过去的饮食摄入完全不同。哮喘组的儿童较对照组摄入更多肉类,膳食纤维摄入减少,两组儿童体重具有统计学差异。膳食纤维对机体的免疫调节相当重要,它在肠道厌氧菌的发酵作用下生成短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs), SCFAs主要包括乙酸、丙酸、丁酸。这些脂肪酸除了用于提供人体5-10%的能量需求外,还对肠道免疫功能的调节起到重要作用,而这种调节作用是通过表达在免疫细胞膜表面的GPR43(G protein-coupled receptor43)受体介导的。G蛋白偶联受体(GPRs)是一种与三聚体G蛋白偶联的细胞表面受体,又称7α螺旋跨膜蛋白受体,在介导细胞间信号转导过程中起着十分重要的调控作用。GPR43受体(G protein-coupled receptor43)是G蛋白偶联受体家族中的一员,最初在寻找新的甘丙肽(Galanin)受体亚型时克隆获得,其编码基因定位于人类第19号染色体19q13.1,与GPR40、GPR41和GPR42串联排列于CD22基因的下游。由于其以SCFAs为特异性受体,故又名为游离脂肪酸受体2(Free fatty acids receptor2, FFAR2)。由于该受体在人类多种组织包括免疫细胞、肠道、脂肪、肺组织等表达,因此具有多种生物学功能,参与了免疫细胞分化迁移、脂质代谢及粘膜免疫等过程,证实与炎症性肠炎、哮喘、类风湿性关节炎、糖尿病、肿瘤等疾病密切相关。在GPR43-/-的类风关、哮喘、炎症性肠炎的小鼠模型上发现炎症均加重,证明了SCFAs通过表达GPR43受体的细胞起到抗炎效果。该受体在白细胞前体分化为各种粒细胞时大量表达,提示GPR43受体在白细胞激活和分化过程中具有重要作用,Vinolo MA用SCFAs体外诱发粒细胞定向迁移(趋化),也是依赖于GPR43受体的激活。经肠道吸收入血的短链脂肪酸与免疫细胞表面的GPR43受体结合,激活MAPK/P38、PLC和ATF-2基因等胞内途径,使胞内信号Ca2+增加,从而产生各种趋化因子及ROS产物,进而诱发外周血免疫细胞迁移至炎症部位,发挥免疫调节的作用。Maslowski K M等用OVA致敏敲除了GPR43基因的小鼠,最后发现基因敲除小鼠表现的气道炎症比野生型小鼠要严重,细胞浸润数明显增加,研究者认为这是因为缺乏GPR43受体的免疫细胞对各种化学引诱物如C5a和炎症趋势因子高度敏感(更容易引起过敏反应)所致。其次,Cox MA在研究中证实SCFAs能通过GPR43受体诱导单核细胞释放前列腺素E2(prostagland E2, PGE2),目前研究表明PGE2能保护下气道的收缩作用。慢性炎症及炎细胞浸润是哮喘重要的病理生理特点,而免疫细胞膜上的GPR43受体与炎症细胞的迁移和免疫调节功能息息相关,因此推测GPR43受体可能参与了哮喘的病生过程,但目前关于支气管哮喘与GPR43受体表达间的关系研究鲜有报导。本研究在建立哮喘小鼠模型的基础上观察GPR43受体在肺组织的表达,探讨GPR43受体在哮喘气道炎症细胞浸润中的作用,进一步使用GC治疗哮喘小鼠,观察GC对该受体的表达调节。二.研究目的研究GPR43受体在小鼠肺组织内的表达,比较对照组及哮喘组GPR43受体的表达有否差异性,同时探讨地塞米松对该受体表达的影响。三.研究方法1.建立哮喘模型根据参考文献,30只BALB/C6小鼠随机分为对照组(A组)、哮喘组(B组)、地塞米松组(C组),每组10只,用卵清白蛋白(Ovalbumin, OVA)和氢氧化铝[Al (OH)3]混合制剂进行腹腔注射致敏、OVA雾化吸入激发的方法制备小鼠哮喘模型。于第0天和第14天每只小鼠腹腔注射0.2ml致敏液含40μg OVA和10mgAl (OH)3,第21天开始,雾化吸入5%的OVA40min,每周3次,为期8周。对照组以生理盐水代替致敏液。地塞米松组在每次雾化前30min腹腔注射2mg/ml浓度的地塞米松,对照组以同等剂量生理盐水代替地塞米松进行腹腔注射。2.标本采集和处理末次雾化24h后断颈处死小鼠,打开胸腔,结扎右侧支气管,用0.9%冰浴生理盐水0.3ml行支气管肺泡灌洗,回收灌洗液。将BALF离心并取上清,沉淀物涂片染色,显微镜下按细胞形态作细胞总数及嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞分类计数。右肺切除后立即投入液氮罐,留待提取RNA。左肺用针头灌注4%多聚甲醛液,然后切除置于4%多聚甲醛液中固定,24h后肺组织行石蜡包埋切片。3.评估哮喘模型建立效果肺泡灌洗液(BALF)细胞计数,HE染色观察各组气道炎症发生及气道结构改变情况,计算单位长度基底膜的气道管壁面积(WAt/Pbm)评估造模效果。4.检测GPR43受体mRNA及蛋白在小鼠肺组织中的表达和观察GPR43受体在肺气道上皮及上皮下的分布情况RT-PCR测定各组小鼠肺组织GPR43受体mRNA的表达变化,免疫组化观察肺中GPR43受体的表达及定位,通过Western blot技术检测小鼠肺组织中FPR43蛋白的表达。5.统计学分析采用SPSS13.0进行统计分析。计量数据用均数±标准差(x±s)表示,各组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA), Levene法进行方差齐性检验,方差齐时组间两两比较用LSD法,方差不齐的计量数据采用校正的F检验(Welch法),并选用Dunnet T3法做多重比较。P<0.05认为差别有统计学意义。四.结果1.两组小鼠的总体外观哮喘模型组：雾化吸入OVA后小鼠表现烦躁不安、呼吸急促、鼻翼煽动、腹肌抽搐、大小便失禁等症状,严重者出现四肢瘫软、毛色失去光泽。正常对照组：雾化吸入OVA后小鼠活动如常、呼吸平稳、毛发顺泽,无烦躁不安、呼吸急促等表现。地塞米松组：雾化吸入OVA后小鼠频繁挠嘴、活动量增加,但程度较哮喘组轻。2.小鼠气道炎症的评估BALF计数可见哮喘组细胞总数(26.765±1.929)、嗜酸性粒细胞计数(4.686±0.463)、嗜酸性粒细胞(17.039±1.148)、淋巴细胞(30.436±1.775)及巨噬细胞分类计数(43.454±4.521)均升高,与对照组(13.556±1.210、0.081±0.006、0.248±0.092、11.283±1.399、83.712±4.390)、地塞米松组(18.433±0.625、1.091±0.109、4.746±0.516、20.529±1.551、55.137±3.412)有统计学差异(P<0.01)。肺组织切片染色：哮喘模型组小鼠气道管腔痉挛,上皮细胞增生脱落,气道粘液分泌增加,气道及血管周围浸润大量炎性细胞,以嗜酸性粒细胞为主,肺间质及肺泡腔也可见嗜酸性粒细胞存在。正常对照组小鼠气道上皮完整,气道及血管周围仅见极少量炎性细胞。地塞米松组小鼠支气管黏膜上皮、黏膜肌层结构较完整,支气管腔规则,部分仍有轻微破坏,支气管黏膜下EOS明显减少。HE染色图像分析结果表明,哮喘组(18.35±1.00)小鼠WAt/Pbm值较对照组(9.31±0.46)明显增高,两组比较差异有显著性(P<0.01),地塞米松组(12.34±2.13)上述指标较哮喘组明显下降,差异有显著性(P<0.01),地塞米松组与对照组相比WAt/Pbm值增高,(P<0.05)。3.GPR43受体在各组小鼠肺组织中的表达及意义RT-PCR分析表明哮喘组GPR43受体mRNA表达量(0.512±0.067)较对照组(1.031±0.266)、地塞米松组(0.759±0.046)明显降低,差异有显著性(P<0.01),地塞米松组与对照组相比上述指标下降(P<0.05)。免疫组化图像分析结果显示GPR43受体在小鼠肺组织的气道上皮、上皮下粘膜组织、血管内皮均有表达,哮喘组大量炎症细胞(包括嗜酸性粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞、巨噬细胞)皆有表达。哮喘组表达强度(1.375±0.115)均明显弱于对照组(2.109±0.135)、地塞米松组(1.78±0.070)(P<0.01),地塞米松组与对照组相比上述指标下降(P<0.05)。免疫印迹结果提示哮喘组小鼠肺组织GPR43受体的表达水平(0.24±0.06)要明显低于对照组(1.28±0.09)小鼠(P<0.01),地塞米松组蛋白水平(0.77±0.09)较哮喘组明显提高(P<0.01),但仍低于对照组(P<0.01)。五.结论1.GPR43受体在小鼠肺组织广泛分布,包括气道上皮、上皮下浸润的炎性细胞、血管内皮及肺泡上皮组织,GPR43受体与气道疾病有一定相关性。2.哮喘组GPR43表达显著低于对照组,表明GPR43受体表达减少参与哮喘的病理生理过程。给予地塞米松治疗后GPR43较哮喘组表达量显著回升,表明地塞米松可能恢复GPR43的表达,证明哮喘的形成与免疫细胞及肺组织GPR43的表达减少有关,同时也提示了地塞米松对GPR43参与的代谢性疾病或许存在某些相关性。3.哮喘模型组的小鼠肺组织中GPR43受体的表达明显减弱,且主要表达于哮喘小鼠肺组织浸润的炎性细胞、气道上皮细胞和血管内皮细胞,这些细胞可能是GPR43途径作用于哮喘的主要靶细胞。4.哮喘组小鼠肺组织GPR43的表达显著低于对照组,表明哮喘和GPR43参与的代谢性疾病或许存在某些相关性,例如肥胖、饮食结构、营养状态及抗生素的使用与哮喘或许呈相关性。