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茶树(Camellia sinensis)是我国重要的木本经济作物,害虫常年发生严重,严重影响我国茶叶的产量和品质。因此,深入挖掘茶树中的重要抗虫基因,分析其在茶树防御中的作用及机理,对茶树抗虫育种技术的开展及茶树害虫防治相关绿色农药的开发均具有重要意义。多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是植物体内重要的防御酶,在植食性昆虫诱导的植物抗虫防御反应过程中发挥着重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE技术从茶树中克隆得到了 2条多酚氧化酶基因CsPPO1和CsPPO2,以及同属多酚氧化酶类的2条漆酶基因CsLAC4和CsLAC12的全长序列,并对其进行生物信息学分析。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)分析这些基因在茶树不同组织部位和不同处理条件下的表达量变化情况,初步明确其在茶树组织中的表达模式以及对不同处理的响应情况,为今后茶树抗虫基因工程的研究提供了较优的候选基因和理论依据。主要实验结果如下:1.通过对实验室前期的转录组测序结果进行筛选,获得了 2条PPO基因的转录本序列,以‘龙井43’茶苗为材料,利用RACE-PCR和RT-PCR技术克隆得到了 PPO基因家族2个成员—CsPPO1和CsPPO2的cDNA全长序列。生物信息学分析显示,CsPPO1和CsPPO2的开放阅读框(ORF)长度分别为1740 bp和1788 bp,分别编码579和595个氨基酸,蛋白分子量分别为64.6 kDa和65.9 kDa,等电点分别为6.74和6.61。PPO家族基因较为保守,不同物种之间的PPO序列也具有较高相似性,都含有Tyrosinase,PPO 1-DWL和PPO-KFDV这3个典型的保守结构域。进化树分析结果显示,茶树的PPO与莲花(Nelumbo nucifeera)和美洲商陆(Phytolacca americana)的PPO基因亲缘关系较近,与番茄和烟草PPO基因的亲缘关系较远。2.荧光定量PCR结果表明,CsPPO1和CsPPO2在茶树组织中的表达模式不同,CsPPO1在茎中的表达量最高,而CsPPO2在根中的表达量最高,在茎中的表达量最低。并且,CsPPO1和CsPPO2对不同处理的响应也存在显著差异。例如,机械损伤和茶尺蠖幼虫取食处理能够诱导CsPPO1和CsPPO2表达量的显著升高,而JA处理只诱导CsPPO2表达量的显著升高,CsPPOi对茉莉酸处理无明显响应。此外,茶尺蠖幼虫反吐液能显著增强CsPPO2对机械损伤的响应强度,在处理12 h和24 h时,分别是机械损伤处理的2.22倍和3.73倍;但CsPPO1的表达量在单独机械损伤和机械损伤与反吐液复合处理之间无显著差异。这说明CsPPO1和CsPPO2在茶树的防御过程中都发挥着一定作用,但CsPPO2对各种胁迫响应更为强烈,可能承担着更重要的防御功能。3.漆酶(Laccases,LAC)又称漆酚氧化酶,为含铜的糖蛋白,是多酚氧化酶的一种。本研究从实验室茶树转录组数据进一步筛选获得2条漆酶基因转录本序列,克隆得到2条漆酶基因的cDNA全长,分别命名为CsLAC4和CsLAC12。它们的开放阅读框分别为1665 bp和1743 bp,分别编码555和581个氨基酸。生物信息学分析显示,CsLAC4和CsLAC12蛋白分子量分别为61.1 kDa和63.9 kDa,理论等电点分别为8.34和9.18;均具有植物漆酶的3个典型离子结合域;N端都存在信号肽,为分泌性蛋白;CsLAC4无跨膜结构域,而CsLAC12存在跨膜结构域,系统进化分析中聚在不同分枝。qRT-PCR分析结果表明,CsLAC4和CsLAC12在茶树不同组织部位的表达模式相似,均在茎中表达量最高,CsLAC4在花和种子中表达量最低,CsLAC12在种子中表达量最低。茉莉酸、机械损伤和茶尺蠖幼虫取食处理均显著诱导了CsLAC4基因表达量的提高,而茉莉酸和机械损伤处理显著抑制了CsLAC12基因的表达,但是茶尺蠖幼虫取食处理却显著诱导了CsLAC12基因的表达。上述研究结果表明,CsLAC4和CsLAC12均参与茶树对茉莉酸、机械损伤和茶尺蠖幼虫取食的响应,但发挥的具体功能可能不同。CsLAC12在机械损伤处理时表达量显著降低,而在茶尺蠖幼虫取食时表达量显著升高,表明茶树能够特异识别茶尺蠖幼虫取食的危害,并可能对茶尺蠖幼虫取食过程中释放的口腔分泌物具有特异的响应。