目的通过昼夜不同时间应用青藤碱(sinomenine,SIN)或艾拉莫德(Iguratimod,T-614),分析其对胶原诱导关节炎(Collagen induced arthritis,CIA)的治疗作用和相关毒副作用的昼夜差异及其可能机制,为进一步开展时间治疗学的临床应用提供实验依据。方法1青藤碱与艾拉莫德对CIA大鼠的时间治疗学及其机制研究80只SPF级健康雄性Wistar大鼠(体重120±10g),饲养于时间生物学实验室[明期为08:00~20:00,暗期为20:00~08:00;授时时间(Zeitgeber time,ZT),实验中以ZT0~ZT12为明期],自由摄食饮水,适应性饲养10天。后将80只大鼠随机分成造模组70只,空白组(NG组)10只。造模组大鼠在无菌操作环境下,分别于0d及14d两次皮下注射牛Ⅱ型胶原(CⅡ)建立CIA模型。实验期间(0d-50d)每7天检测大鼠右后足容积、体重。于21d将CIA模型成功大鼠,根据关节炎评分均分至SIN-ZT0、SIN-ZT12、T-614-ZT0、T-614-ZT12组及模型组(M组),每组10只;NG组10只。22d开始进行药物干预,SIN时间治疗组灌胃给予青藤碱(150mg/Kg·d-1,2m L)、T-614时间治疗组灌胃给予艾拉莫德(6mg/Kg·d-1;2m L)、M组及NG组灌胃给予等体积羧甲基纤维素钠,干预28天。49d拍摄大鼠足爪X线片,50d于ZT0-ZT3,应用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉下断头处死大鼠,取血,分离血清,低温保存备检;取踝关节,固定,脱钙,石蜡包埋,石蜡组织切片备用。应用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunsorbent assay,ELISA)检测血清肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、褪黑素(Melatonin,MLT)及皮质酮(Corticosterone,CORT)含量,苏木素-伊红染色法(HE染色法)显微镜下观察足踝滑膜病理改变,免疫组织化学技术(SP技术)检测足踝组织TNF-α、IL-1β、骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)、核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)、钟基因表达蛋白(CLOCK、BMAL1)表达情况。2青藤碱与艾拉莫德的时间毒理学初步探讨60只SPF级健康雄性昆明小鼠(体重20±10g),饲养于上述时间生物学实验室。适应性饲养10天,自由摄食饮水。后将小鼠随机分至SIN-ZT0、SIN-ZT12、T-614-ZT0、T-614-ZT12、NG组,每组12只。0d~21d进行药物干预,SIN时间毒理组灌胃给予青藤碱(150mg/Kg·d-1;0.9m L)、T-614时间毒理组灌胃灌胃给予艾拉莫德(6mg/Kg·d-1;0.9m L)、NG组灌胃给予等体积羧甲基纤维素钠。22d于ZT0-ZT1断头处死小鼠,取血,分离血浆,低温保存备检。应用微板法检测T-614-ZT0、T-614-ZT12、NG组血浆谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(Acute suppurative thyroiditis,AST)含量,ELISA法检测SIN-ZT0、SIN-ZT12、NG组血浆组胺(Histamine,HIS)含量。所有数据均应用IBM SPSS21.0软件处理,计量资料符合正态分布数据用均数±标准差((?)±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析处理;两两比较,方差齐时采用LSD法检验;方差不齐时采用Dunnett’s T3法检验,检验标准为α=0.05。结果1青藤碱与艾拉莫德对CIA大鼠的时间治疗学及其机制研究1.1一般生长状况及体重比较给药前,关节炎大鼠较烦躁,被毛光泽变差、脱毛,精神萎靡,组内打斗现象较为频繁。部分大鼠因足爪肿胀疼痛或关节僵直而活动受限,因疼痛或者慢性炎症纳食水较少,体型瘦弱。各治疗组给药后,饮食水较给药前频繁,脱毛现象减少,光泽度增加。大鼠活动量渐增加,组内打斗现象减少,关节僵直改善。M组大鼠经两次CⅡ免疫后体重增长出现迟滞现象,药物干预后,SIN治疗组大鼠体重增长较NG组缓慢,DAY42、DAY49,SIN治疗组大鼠体重高于M组大鼠;其中SIN-ZT0组大鼠体重一直低于SIN-ZT12组,且两组体重差距逐渐变大。T-614治疗组大鼠体重增长较NG组缓慢,DAY35开始M组大鼠体重始终低于T-614治疗组;于DAY42、DAY49,T-614-ZT12组大鼠体重显著高于M组(P<0.05);DAY42,T-614-ZT8组大鼠体重显著高于M组(P<0.05);但T-614-ZT0组大鼠于DAY35开始,体重始终低于T-614-ZT12组。1.2时间治疗组右足容积变化:SIN干预后,大鼠足爪容积迅速下降,于DAY35、DAY42,SIN-ZT0、SIN-ZT12组大鼠足爪容积显著低于M组(P<0.05);于DAY35、DAY42、DAY49,SIN-ZT12组足爪容积始终低于SINZT0组。T-614干预后,大鼠足爪容积迅速下降,于DAY28~DAY42,M组足爪容积显著高于T-614-ZT0、T-614-ZT12组(P<0.05);DAY49,M组足爪容积显著高于T-614-ZT12组(P<0.05);且于DAY35~DAY49,T-614-ZT12组足爪容积始终低于T-614-ZT0组。1.3关节影像学变化:给药4周后,M组可见踝关节面模糊,骨缺损明显,软组织肿胀较明显;后足掌指关节间隙均匀变窄,骨质疏松明显;大部分大鼠前爪亦出现不同程度关节骨质破坏,间隙变窄,软组织肿胀等表现。SIN-ZT0组大鼠踝关节破坏及关节面模糊程度轻,部分关节可见骨缺损,关节间隙变窄,骨质疏松;SIN-ZT12组大鼠踝关节面尚可见,骨破坏程度轻于SIN-ZT0组。T-614-ZT0组大鼠踝关节面均可见,可见踝关节间隙变窄伴见骨质疏松;T-614-ZT12组大鼠踝关节面均可见,骨破坏程度较T-614-ZT0组为轻。1.4大鼠血清TNF-α、IL-1β、褪黑素及皮质酮含量:4周后,M组大鼠血清细胞因子(TNF-α、IL-1β)、褪黑素含量较NG组显著升高(P<0.01),血清皮质酮含量较NG组显著降低(P<0.01);SIN及T-614时间治疗组大鼠血清细胞因子(TNF-α、IL-1β)、褪黑素含量较M组显著降低(P<0.01、P<0.05),血清皮质酮含量显著升高(P<0.01);SIN及T-614干预4周后,各自ZT12组血清细胞因子(TNF-α、IL-1β)含量均显著低于SIN及T-614各自ZT0组(P<0.05);SIN及T-614各自ZT12组血清褪黑素含量高于SIN及T-614各自ZT0组(P<0.05),而SIN及T-614各自ZT12组与NG组相比无显著差异(P>0.05);SIN及T-614各自ZT12组血清皮质酮含量较SIN及T-614各自ZT0组为高(P<0.05)。1.5踝关节组织病理变化:M组大鼠踝关节滑膜HE染色可见4~7层、排列疏松紊乱的滑膜细胞,部分可见滑膜细胞乳头状增生、淋巴细胞浸润、淋巴细胞聚集现象,严重者可见多核巨噬细胞、关节滑膜内血管增生,血管翳形成侵蚀骨小梁,软骨骨破坏。SIN及T-614治疗组中,ZT12给药组滑膜增生均较ZT0给药组为轻,滑膜细胞下淋巴细胞浸润较轻;偶可见滑膜细胞乳头状增生,但仍以ZT0给药组为重。1.6踝关节组织TNF-α、IL-1β、OPG、RANKL、CLOCK、BMAL1表达:M组大鼠踝关节TNF-α、IL-1β、OPG、RANKL、CLOCK、BMAL1的表达明显高于NG组,OPG表达低于NG组;SIN、T-614治疗组与M组比较TNF-α、IL-1β、RANKL、CLOCK、BMAL1的表达明显降低,OPG表达高于M组;SIN及T-614治疗组,除OPG外上述指标均出现ZT0组较ZT12组表达高,OPG表达则出现ZT12组高于ZT0组。2青藤碱与艾拉莫德的时间毒理学初步探讨2.1小鼠一般生长状况及体重变化:NG组小鼠体重在第一周增长迅速,第二、三周增长速度逐渐减慢,较活跃。SIN及T-614毒理组小鼠,体重较NG组增长缓慢,其中ZT12组增长最慢;干预后第一、二周活动较频繁,之后活动较NG组减少;T-614毒理组偶有组内打斗现象及上肢两侧抓痕导致的脱毛现象。SIN干预后DAY14、DAY21,SIN-ZT12组体重显著低于空白组(P<0.05);T-614干预后DAY7、DAY14,T-614-ZT12组体重显著低于NG组(P<0.01);SIN及T-614毒理组,ZT12组体重自干预后始终低于ZT0组。2.2青藤碱干预后小鼠血浆组胺含量:SIN干预3周后,SIN-ZT0、SIN-ZT12组小鼠血浆组胺含量呈现较高水平,均显著高于NG组(P<0.05、P<0.01)。其中,SIN-ZT12组显著高于SIN-ZT0组(P<0.05)。2.3艾拉莫德干预后小鼠血浆AST、ALT含量:T-614干预3周后,两组小鼠血浆AST含量较NG组为高,其中T-614-ZT12组显著高于NG组(P<0.05);T-614-ZT12组较T-614-ZT0组稍高。两组小鼠血浆ALT含量较NG组显著升高(P<0.01);T-614-ZT12组较T-614-ZT0组血浆ALT含量稍高。结论1青藤碱与艾拉莫德昼夜不同时间干预CIA大鼠,治疗效果存在昼夜差异,原因与晚8点给予药物干预较早8点血清及关节炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β)低表达及皮质酮高表达,滑膜组织OPG高表达、RANKL低表达有关。其机制可能与褪黑素、钟基因调控昼夜皮质酮分泌或调节炎性细胞因子表达水平有关。2青藤碱与艾拉莫德昼夜不同时间干预正常昆明小鼠,出现青藤碱晚8点组血浆组胺表达高于早8点组;艾拉莫德晚8点组肝功能损伤(AST、ALT)稍高于早8点组,其机制有待进一步研究。