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莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn.)为多年生草本水生植物藕莲膨出肥大的根状茎,是一种深受人们喜欢的药食同源性食品。由于它有着丰富的药用价值与营养价值,人们对其加工品及鲜食的需求量不断加大。但是,莲藕在加工、贮藏与运输过程中普遍存在失水萎蔫、褐变等问题,导致商品性下降,鲜食货架期短,严重影响了莲藕鲜食和加工产品的出口创汇。由前人探索发现,多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是导致莲藕发生酶促褐变的关键酶之一。本文利用生物信息学方法鉴定并分析了所有PPO基因家族成员,并通过试剂盒以及q RT-PCR方法分别检测PPO和其家族基因在不同组织、不同生长时间、不同诱导因子下的活性与响应。在实验室前期的基础上,通过q RT-PCR以及酵母双杂交方法对PPO1与其互作基因GLK1、NADH的表达和互作位点进行分析。主要得出以下结果:1. 根据莲藕PPO家族序列的结构域,在莲基因组数据库中进行比对搜索,再通过Pfam网站验证得到4个基因家族成员:PPO1、PPO4、AS-1与AS-2。利用生物信息学方法对其理化性质、跨膜区、信号肽、基因结构、保守基序、二级与三级结构进行预测分析发现,PPO1与PPO4在基因、蛋白序列和结构上更为相似,同样,AS-1与AS-2在基因、蛋白序列和结构上也非常相似。2. 取不同试验材料,利用试剂盒以及q RT-PCR方法分别检测PPO和其家族基因在不同组织、不同诱导因子、不同生长时间下的活性与响应。结果表明,PPO家族基因在莲藕中具有组织表达特异性,PPO1与PPO4在幼芽中表达量较高,AS-1于根中高量表达,AS-2则在叶中表达量较高。PPO家族基因的表达与PPO的活性密切相关,PPO1、PPO4、AS-1基因的表达量和PPO的活性在不同诱导处理下均不同程度的升高,而AS-2无明显变化。PPO家族基因的表达具有明显的时间特异性,PPO1、PPO4与AS-1的表达量在莲藕生长至第30 d左右开始快速上升,而AS-2无明显变化。3. 采用不同诱导处理的莲藕叶片和茎作为试验材料,测定叶绿素含量以及超氧阴离子自由基含量。并且通过q RT-PCR方法分别检测PPO1与其互作基因GLK1、NADH在莲藕不同组织和不同诱导下的表达量。结果表明,酵母提取物、Ag~+、抗坏血酸以及L-半胱氨酸4种不同处理均会引起莲藕不同程度的自由基堆积,激发莲藕程度不一的非生物胁迫响应;均使PPO1和GLK1的表达量升高,而NADH无明显变化。GLK1在酵母提取物和抗坏血酸处理下表达量显著升高,而叶绿素含量却有所下降。GLK1具有组织表达特异性,在水培莲藕茎中的表达量较高,而NADH在各组织中的表达量无明显差异。4. 在实验室前期基础上,根据PPO1与GLK1的结构域以及特异性结合位点进行氨基酸序列截短,分别构建截短诱饵载体和猎物载体,共转入Y2H Gold酵母中进行验证。结果表明,PPO1的Cu A、Cu B催化活性中心区域与GLK1包含GCT-box结构域的后半段为该两者的互作位点。