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研究背景支气管哮喘是一种气道慢性炎症性疾病,哮喘患者体内存在神经、内分泌和免疫系统紊乱。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对神经元的生长、分化和发育起促进作用。近年来认为,除了促进气道炎症和重构并加剧免疫应答失衡外,NGF还能启动肾上腺髓质细胞冗余性,使哮喘状态下肾上腺髓质嗜铬细胞有向神经元转化的倾向,导致体内肾上腺素的合成和／或释放障碍,从而参与哮喘的发展。在我们前期的实验中,用差异蛋白质组学技术比较NGF刺激前后蛋白质谱,经筛选并鉴定出17种表达有差异的蛋白。本实验分别通过体外和体内实验验证其中两种蛋白RhoGDIa和peripherin是否参与NGF启动哮喘肾上腺嗜铬细胞冗余性过程。NGF必须依赖一定信号转导通路的介导才能发挥其生物学作用。MAPK信号通路与NGF的生物学效应密切关联。MAPK信号通路是NGF诱导PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤株)分化的主要正调节途径。因此,本研究拟以牛肾上腺髓质嗜铬细胞作为靶细胞,进一步探讨MAPK信号通路是否参与NGF启动肾上腺嗜铬细胞冗余性,并介导其中RhoGDIa和peripherin的表达。目的观察NGF干预对体外培养的牛肾上腺髓质嗜铬细胞(AMCC)中RhoGDIa和peripherin表达的影响,以及NGF抗体对支气管哮喘大鼠肾上腺髓质组织中的上述两种蛋白表达的影响,以期探讨RhoGDIa和peripherin是否参与NGF启动哮喘肾上腺髓质细胞冗余性过程。方法体外验证实验：体外培养牛肾上腺髓质嗜铬细胞,并在相差显微镜和电镜下鉴定AMCC。用100ng/ml NGF干预AMCC,检测NGF干预时间对AMCC中RhoGDIa和peripherin表达水平的影响。用细胞免疫荧光法检测AMCC中RhoGDIa和peripherin的表达部位。体内验证实验：48只SD大鼠随机均分成4组,每组12只(正常对照组,哮喘模型组,NGF干预组,NGF抗体干预组)。用OVA致敏、激发方法建立哮喘模型,对哮喘大鼠分别施予NGF或NGF抗体干预。干预完成后,取各组大鼠肺组织、双侧肾上腺组织。观察各组大鼠支气管肺组织病理变化,用免疫组化方法和Western Blot法检测各组大鼠肾上腺组织中RhoGDIa和peripherin的蛋白表达情况。结果新分离的AMCC在相差显微镜下多呈圆形,折光性强,散在分布。电镜下可见胞质中均匀分布大小不等、电子密度不同的嗜铬颗粒。NGF干预后,RhoGDIa在AMCC的胞浆及胞膜上均有表达,而peripherin仅在AMCC的胞浆中显著表达。NGF干预与AMCC中RhoGDIa和peripherin的表达呈时效关系。其中RhoGDIa的表达水平在NGF刺激48h后明显降低,而peripherin蛋白的表达在刺激48h后显著升高。体内实验中,哮喘模型组和NGF干预组大鼠气道周围有大量炎症细胞浸润,支气管壁和肺泡间隔显著增厚,而与之相比,NGF抗体干预组大鼠气道周围炎症细胞浸润程度明显减轻,支气管和肺泡间隔增厚亦有所改善。免疫组化结果提示,哮喘组大鼠肾上腺髓质组织可见RhoGDIa或peripherin表达阳性的细胞,而且该组RhoGDIa阳性产物的平均灰度值明显高于正常对照组(P<0.01),但peripherin阳性产物的平均灰度值则明显低于正常对照组(P<0.01)(灰度值越低提示表达量越高,反之亦然)。与哮喘组比较,NGF干预组大鼠肾上腺髓质组织中RhoGDIa蛋白阳性产物的灰度值进一步升高(P<0.01),NGF抗体干预组灰度值则明显降低(P<0.01)。然而,NGF干预组大鼠peripherin阳性产物的灰度值显著低于哮喘组(P<0.01),NGF抗体干预组peripherin的灰度值则较哮喘组明显增高(P<0.05)。Western Blot结果显示,哮喘组大鼠肾上腺组织中RhoGDIa蛋白表达的相对密度明显低于对照组(P<0.01)；但与哮喘组比较,NGF干预组和NGF抗体干预组大鼠肾上腺组织中该蛋白表达的相对密度均无明显统计学差异(P>0.05)。哮喘组肾上腺组织中peripherin蛋白表达的相对密度明显高于对照组(P<0.01)；而与哮喘组相比,NGF抗体干预组大鼠肾上腺组织中该蛋白表达的相对密度显著降低(P<0.05),NGF干预组则无明显统计学差异(P>0.05)。结论两个差异蛋白RhoGDIa和peripherin在体内外表达趋势与差异蛋白质组学结果一致。这两种差异蛋白可能参与NGF启动哮喘大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞冗余性过程。目的研究MAPK信号通路是否参与NGF启动肾上腺嗜铬细胞冗余性,并介导其中RhoGDIa和peripherin的表达。方法分离培养AMCC后给予100ng/mlNGF刺激,用Western Blot法检测五个不同时间点p-ERK、p-JNK和p-p38的表达情况,并确定NGF诱导上述磷酸化蛋白表达高峰的时间点。用等量DMSO、50μMPD98059(ERK抑制剂)、20μM SP600125(JNK抑制剂)和20μM SB202190(p38抑制剂)分别处理AMCC30min后,再予100ng/ml NGF继续培养,分别于前述各蛋白表达最强时间点和72h时在电镜下观察AMCC超微结构的变化,收集细胞上清用ELISA法测定肾上腺素(Ad)浓度,并用Western Blot法检测72h时各处理组细胞内RhoGDIa和peripherin的表达。结果AMCC中p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白呈NGF诱导时间依赖性表达。其中p-ERK和p-JNK的表达在NGF刺激15min时达高峰,而p-p38则有15min和90min两个表达高峰。电镜结果显示,NGF刺激72h的AMCC胞浆中嗜铬颗粒明显较少,且聚集在细胞一侧,伴部分空泡样变的线粒体；p38抑制剂SB202190能抑制NGF对AMCC超微结构的影响,而ERK抑制剂PD98059和JNK抑制剂SP600125则不能抑制NGF对AMCC结构的影响。ELISA结果显示,与NGF组比较,三种抑制剂预处理后的细胞上清中Ad浓度在培养15min时无明显改变；而培养72h的结果显示,与NGF组(6.88±0.77)相比,PD+NGF组(4.65±0.36,P<0.01)上清中Ad浓度明显下降,SP+NGF组(6.23±0.54,P>0.05)上清中Ad浓度无明显改变,而SB+NGF组(8.02±0.67,P<0.01)上清中Ad浓度则升高。Western Blot结果显示,SB202190能遏阻NGF对RhoGDIa表达的抑制作用,而且还能抑制NGF诱导peripherin表达的作用,但PD98059和SP600125却无上述作用。结论NGF启动AMCC冗余性中RhoGDIa和peripherin的表达可能是通过p38/MAPK信号转导通路的介导得以实现。