氨基酸生产工艺发展经历了热酸水解、化学合成及酶催化和微生物发酵的过程。随着人口的增加,以及各种氨基酸功能的进一步发展,其市场需求量以每年5-7%的比例稳健增加。L-精氨酸作为人体的半必需氨基酸,在人体中参与了尿素循环、氮元素的代谢并协助氨排出;也参与体内NO合成,间接影响生命体免疫、神经和心血管系统;同时还是作为精蛋白的重要组分之一,能影响人体生殖。因此被广泛用作食品、药品等的添加剂。目前,我国市场上的精氨酸还主要源于外国进口,或国内以猪毛发、动物皮毛作为原材料,经角蛋白酸水解而来。但无论是从经济节约或是环保视角出发,通过国内工程改造的研究,提高精氨酸的产量是最合适的方式。钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)是国内研究者从土壤中分离得到的革兰氏阳性菌,由于其基因组与谷氨酸棒杆菌相似度极高,具有谷氨酸棒杆菌相同的优点,已广泛用于氨基酸的生产,包括精氨酸。本文利用本实验室构建的菌株C.crenatum MT argB M4△TSCP△pta△proB△cg12310△Ncgl1221和C.crenatum MT argB M4△TSCP△pta△proB△cg12310△Ncgl1221△cobB::cg3035为出发株,利用同源重组技术,通过对转录调控因子、副产物支流、NADPH还原力以及精氨酸代谢路径碳流等几方面加以干预,以获得精氨酸高产菌株。首先,在C.crenatum MT argB M4△TSCP△pta△proB△cg12310△Ncgl1221菌中以大肠杆菌的lacI启动子替换转录调控因子farR原有的启动子,弱化脂肪酸相应蛋白FarR表达,荧光定量PCR鉴定结果显示,参与精氨酸合成基因gdh和argB表达量下调,参与NADPH合成基因zwf和gnd表达量下调,而与ODHC活性正相关基因odhA上调,负相关基因odhI表达量则下调;摇瓶发酵结果显示,细胞生长和葡萄糖消耗几乎无差异,但精氨酸产量下降约15%。说明FarR并不是精氨酸合成网络的负调控蛋白。其次,在C.crenatum MT argB M4△TSCP△pta△proB△cg12310△Ncgl1221△cobB::cg3035中将腐氨合成关键基因speE通过同源重组技术敲除,切除鸟氨酸分解代谢的副产物支路,精氨酸产量随发酵时间延长上升,120小时时上升到25%之多。最后,在C.crenatum MT argB M4△TSCP△pta△proB△cg12310△Ncgl1221△cobB::cg3035中异源表达丙酮丁醇梭菌gapC,其表达蛋白能催化产生NADPH和3-磷酸甘油醛,增加胞内NADPH积累。摇瓶发酵结果显示,精氨酸产量提升了15%;另外,本文基于NADH依赖性酶的挖掘,在菌株△proB位置上,异源表达枯草芽孢杆菌NADH-依赖性的谷氨酸脱氢酶基因rocG,与对照相比,精氨酸产量提高了21.5%。总之,本文通过敲除speE以及异源表达rocG和gapC,分别从阻断支流、增加碳流和增加NADPH积累及弱化farR表达等方面探索钝齿棒杆菌精氨酸高产菌株构建方法。