论文部分内容阅读
本研究分为两部分。
第一部分 MMPs、TIMPs在大鼠早期酒精性心肌病心肌组织中的表达及作用
目的:建立大鼠早期ACM模型为进一步研究人类ACM发病机制及预防、治疗药物提供实验动物对象。本实验动态观察基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及其基质金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)和基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)在大鼠早期ACM发生、发展中心肌组织中的表达、变化情况，并分析其与心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)、心肌组织中丙二醛(MDA)、心脏结构及功能参数(LVEDD、LVESD、LA、E/A、EF、FS)等的相关关系，探讨其在早期ACM心肌病变发生、发展过程中的作用机制，为临床研究ACM发病机制寻找新思路提供实验依据。
方法:选择成年健康SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，体重250～300g，随机分为两组:模型组（24只）、正常对照组(24只)，用白酒灌胃法制备大鼠ACM的动物模型，正常对照组每日予以等容积5％葡萄糖溶液灌胃。定期检测大鼠一般情况，在灌胃后4周末、8周末、12周末、16周末各组随机抽取5只大鼠，予以超声心动图检查;取部分心肌组织匀浆后用硫代巴比妥酸(TBA)法测定心肌组织中MDA的含量，用黄嘌呤氧化酶法测定心肌组织中SOD的含量;用RT-PCR法检测心肌组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2mRNA的表达情况;常规心脏HE染色病理切片，观察心肌组织的病理变化。收集并整理实验数据，应用t检验、直线相关分析等进行统计分析，P＜0.05有统计学意义。
结果:(1)酒精灌胃后，大鼠轻者行走不稳，活动亢进，重者出现嗜睡症状，身体瘫软，刺激后无明显反应，眼结膜充血，大约60分钟后以上症状消失;随着时间推移，后期实验中（灌胃4周后），模型组大鼠少食、少动，大便稀，毛色发黄，无光泽，体态呆板、行动迟缓、反应迟钝、嗜睡，易激惹，体重增长缓慢。
(2)第4周末，模型组大鼠心肌组织中MDA升高，高于正常对照组(P＜0.05)，SOD反之，且随着时间的推移，酒精摄入量的增多，心肌组织中MDA逐渐增高，SOD活性下降，从第8周末开始模型组大鼠出现左心扩大、左室舒张功能减低，心肌组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、 TIMP-2mRNA表达水平上调， TIMP-2/MMP-2和TIMP-1/MMP-9比值下降，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，在16周末显微镜下显示心脏形态学变化:心肌细胞肥大，心肌纤维排列紊乱，心肌间质炎症细胞浸润，结合超声结果提示在此实验条件下，早期ACM大鼠模型建立成功。
(3)相关关系:将各组大鼠心肌组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2mRNA表达情况及TIMP-2/MMP-2、TIMP-1/MMP-9比值与心脏结构和功能参数等进行相关分析，结果显示:MMP-2和MMP-9与大鼠心脏结构大小（LVEDD、LVESD、LA）、心肌组织中MDA均存在正相关关系，而TIMP-2/MMP-2、TIMP-1/MMP-9与之负相关(P均＜0.01);MMP-2、MMP-9与心肌组织中SOD、E/A显著负相关，TIMP-2/MMP-2和TIMP-1/MMP-9比值与之显著正相关（P均＜0.01）。
结论:在本实验条件下，早期ACM大鼠模型制备成功，在大鼠早期ACM的发生、发展过程中，酒精导致氧化应激损伤心肌细胞，引起心肌组织中MDA升高、SOD下降，引发MMP-2、MMP-9和TIMP-1、TIMP-2水平进行性增高，并使TIMP-2/MMP-2和TIMP-1/MMP-9比值失衡，导致细胞外基质(ECM)降解，心肌胶原代谢失衡，心肌纤维化，导致心脏重构，心功能下降，提示MMPs/TIMPs表达失衡参与ACM左室重构和心功能下降的发生、发展过程。
第二部分小檗碱对早期ACM大鼠模型的治疗作用及机制的研究
目的:本实验通过对大鼠早期ACM模型予以小檗碱(BBR)干预治疗，观察BBR对治疗前后早期ACM大鼠心肌组织中MDA和SOD，心肌组织中MMPs及TIMPs基因表达、心脏结构和功能参数及形态学变化的影响，探讨BBR对早期ACM大鼠心脏保护作用及其作用机制，为该药在临床研究与治疗ACM提供实验依据。
方法:选择与第一部分同源同批次的成年健康SPF级雄性SD大鼠40只，随机抽取SD大鼠10只作为正常对照组，另30只SD大鼠参照第一部分实验方法建立早期大鼠ACM模型。将建立成功的早期ACM模型的SD大鼠（24只）随机分为小檗碱治疗组（以下简称:BBR组）、安慰剂对照组（以下简称:安慰剂组），每组12只。BBR组予以BBR200mg/kg/d，灌胃4周，安慰剂组和正常组予以等量蒸馏水灌胃4周。干预4周后超声心动图检测各组大鼠心脏结构及功能;用TBA法测定心肌组织中MDA的含量，用黄嘌呤氧化酶法测定心肌组织中SOD的含量;RT-PCR检测MMPs及TIMPs基因在心肌组织中的表达;心脏切片HE染色观察形态学变化。
结果:(1)白酒灌胃大鼠建立早期ACM大鼠模型，16周末对全部存活大鼠行超声心动图检测，均显示为:左心扩大、左室舒张功能下降，与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，并从中随机抽取4只大鼠行病理切片HE染色，显微镜下显示:心肌细胞肥大，心肌纤维排列紊乱，心肌间质炎症细胞浸润。通过以上综合评定，提示早期ACM大鼠模型建立成功。建模分组后，BBR组和安慰剂组大鼠体重、心脏大小及功能均无显著性差异，条件齐同。
(2)干预4周后，BBR组与安慰剂组比较，心肌组织中SOD升高，MDA下降，LVEDD、LVESD、LA减小，Em/Am比值上升，心肌组织中的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2mRNA表达水平显著下降，TIMP-2/MMP-2和TIMP-1/MMP-9比值升高（P均＜0.05）。BBR组显微镜下显示部分心肌细胞肥大，心肌间质无炎性细胞浸润，血管壁结构正常、无破裂。
结论:BBR可能通过提高心肌组织中SOD活性，抑制MDA生成，减少刺激心肌组织中MMPs过度表达，纠正MMPs/TIMPs的表达异常，抑制心肌ECM降解，防止心肌胶原蛋白过度降解，心肌纤维化，逆转大鼠ACM的心室重构进程，进而改善心功能，达到保护与治疗早期ACM心肌病变的作用。