一、背景近几年,世界性疾病曲线图呈现出新的趋势,心血管疾病的致死率已从之前的十分之一提升至三分之一,成为全球致死率较高的一类疾病,被称为“头号杀手”,大量研究发现,与此类疾病发生关系密切的是动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)。随着我国生活水平的不断升高,人们生活方式也发生了巨大的变化,动脉粥样硬化成为我国主要的致死事件。动脉粥样硬化是心、脑血管疾病之根本,主要发生于血管内膜上,对冠状动脉、主动脉、外周血管和大脑血管的病理变化都有影响。随着疾病发展,内膜显现出淡黄色的脂质类沉积,进而形成血栓,促成纤维组织生成和钙性物质的积聚,从而使内膜管壁发生钙化。由于动脉粥样硬化的病理机制的复杂性,对其研究已有近百年,较多研究发现,炎症反应能够促进血管内膜的平滑肌细胞不断增生,同时血管的内皮功能被损害,从而促进动脉粥样硬化斑块开始生成,进而印证了动脉粥样硬化的疾病性质是炎症性的。从中医学角度探讨动脉粥样硬化,需要坚持“整体观念”和“辨证论治”两个原则,与代谢组学研究的综合性、整体互动性和全景式的特征相一致,且其在中医药领域中,如:中医证候、疾病发病机制、中药药性及作用机制等方面取得了一定的成就,引起了各国学者的高度关注,对动脉粥样硬化的研究转向与代谢组学相结合的研究模式。既往研究提示,大多从活血化瘀法联合清热解毒法治疗动脉粥样硬化的药物疗效及作用机制进行探讨,但与代谢组学仍需进一步的结合,利于找寻其中医干预靶点。本实验采用活血化瘀联合清热解毒法的四妙勇安汤进行干预,观察其对ApoE-/-小鼠血脂水平、炎症因子及动脉粥样硬化斑块的病理变化,并结合代谢组学技术,找寻ApoE-/-小鼠高脂后(即斑块形成时)的差异性代谢物,观察中药干预后各差异性代谢物的变化,探讨其干预作用。二、研究目的通过代谢组学技术,找寻As斑块形成时的差异性代谢物,为As的早期诊断及治疗提供新靶点,进而为其更深入的病理机制研究奠定理论基础。三、研究方法7周龄的ApoE-/-小鼠(品系C57BL/6J,雄性),并以7周龄的C57BL/6J雄性小鼠为对照组,适应性喂养一周,ApoE-/-小鼠改高脂饲料,C57BL/6J小鼠继续基础饲料喂养,同时喂养14周,ApoE-/-小鼠随机取两只,进行油红0染色,确定斑块形成后,各组随机取10只小鼠,血脂检测和主动脉HE染色,进一步确认As斑块是否形成。确认斑块形成后,ApoE-/-小鼠随机分为5组:模型组、阳性药组、中药高组、中药中组、中药低组及以C57BL/6J小鼠为代表的对照组,于喂养15周开始给药。阳性药组2.57mg/kg,中药高组34.9g/kg,中药中组23.14g/kg,中药低组11.61g/kg,每日灌胃一次;模型组和对照组灌服等剂量的去离子水。每组小鼠自由食水,每周对小鼠进行体重测量,调整用药剂量并观察其生长状态的变化,药物干预12周,采用自动生化仪通过酶法检测血脂,双抗体夹心法测定hs-CRP,主动脉HE染色法观察病理形态改变。同时与代谢组学相结合,基于UPLC-TOF-MS技术对小鼠血清进行代谢组学分析,获得各组样品不同时间的代谢轮廓图谱,并运用偏最小二乘法进行数据分析,找出As斑块形成时的差异性代谢物,并观察中药干预后各差异代谢物的变化。四、结果1.高脂饲料喂养14周后,与对照组相比,模型组TC、TG、LDL水平有显著差异(P<0.01);油红0染色发现,模型组小鼠主动脉内膜增厚且可发现明显的脂质颗粒物质沉积;HE染色发现,模型组小鼠主动脉壁厚薄不均,内膜不光滑,血管壁向管腔内突出,充斥着大量脂质泡沫细胞,提示造模成功。2.ApoE-/-小鼠在高脂饲料喂养0天与喂养98天的血脂水平相比较,血清TC、LDL水平显著升高(P<0.01);而喂养高脂饲料182天与喂养98天相比,血脂HDL水平显著下降(P<0.01),其余无明显变化。3.药物干预12周后,与模型组相比,各给药组As病变得到不同程度的控制,中药低组主动脉斑块面积明显变小,仅有少量的泡沫细胞;阳性药组、中药高组及中药中组斑块面积减小,脂质沉积和胆固醇结晶明显减少。各给药组对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变具有抑制作用,尤以中药低组较为显著。4.与模型组相比,中药高、中、低剂量组和阳性药组的血脂水平无差异(P>0.05);与模型组相比,中药高、中、低剂量组和阳性药组的hs-CRP水平无显著差异(P>0.05)。5.正离子模式下找出了 As斑块形成时的33种差异性代谢物,在负离子模式下找出了 25种差异性代谢物,涉及7类成分(脂肪酸、甘油脂、聚酮、固醇脂质、Prenol脂质、吡咯类、脂肪酰基类),其中以脂肪酸与As的关系较为密切,其次为甘油脂。6.在正离子模式下,四妙勇安汤下调棕榈酸、庚酸乙酰、不饱和羧基化合物、棕榈油酰乙醇酰胺、十四烯二酸二甲脂、十五烷基、十八基。在负离子模式下,四妙勇安汤下调十七烷酸、戊酰丁酸、十八碳酸、羧基喹啉庚二稀、葡萄糖苷;上调十五烷,从而说明四妙勇安汤通过下调脂肪酸和甘油脂类促进脂质代谢,起到抑制As的作用。五、结论1.ApoE-/-小鼠在高脂饲料喂养14周,可形成As斑块。2.通过病理发现,各给药组小鼠的主动脉动脉粥样硬化病变得到不同程度的控制,尤以中药低组效果较为显著。但对血脂及hs-CRP的影响并没有显著的变化,有以下几方面的原因:第一,小鼠为基因敲除型,对药物的敏感度低;第二,动脉粥样硬化为一慢性疾病,给药时间短,无法达到预期疗效;第三,氧化的脂蛋白是作用内皮细胞的主要因素,应进一步对血清中丙二醇(MDA)、氧化低密度脂蛋白进行检测;第四,hs-CRP是一种非特异性的指标,虽然应用于心系系统比较广泛,但与感染、损伤及多种疾病都具有相关性,受小鼠体质及外部因素的影响较大,应进一步对其他炎症因子进行检测。3.基于代谢组学的研究,我们发现不同类别的差异代谢物对应不同的作用靶点及网络信号通路,且四妙勇安汤调节多个差异代谢物,对多个体内物质发挥调节作用。