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恶性肿瘤是目前严重威胁人类生命健康的第一杀手,其治疗方法种类繁多。其中,化疗在防止复发、巩固治疗等方面起着不可替代的作用。然而,在长期反复的化疗过程中常会由于肿瘤细胞产生耐药性和严重的骨髓抑制,造成治疗的失败。大量实验研究证实,造成化疗失败原因与多药耐药（multid-rug resistance genel,mdrl）基因及其编码产物p-gp糖蛋白（p-glycoprotein,p-gp）有密切关系,这两种物质在肿瘤细胞内高水平表达,具有能量依赖的跨膜药物外输泵的功能,使胞内药物聚集浓度降低,而产生耐药[1]。正常骨髓细胞低表达mdrl,因此对化疗药物敏感,使得其极易被化疗药物损伤,产生骨髓毒性,成为限制化疗疗效提高的重要原因。如能增强正常骨髓细胞中mdrl的表达,利用其耐药特性,提高骨髓细胞的耐药性,使大剂量化疗能够顺利进行,这对于恶性肿瘤的治疗具有重要的意义。干细胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。骨髓中存在两种干细胞,造血干细胞（haemopoietic stem cells,HSCs）和间充质干细胞（mesenchymalstem cells,MSCs）,前者主要维持体内的造血功能,后者具备向多种胚层组织细胞分化的能力。以往有研究将mdrl基因导入造血干细胞,试图通过过表达的mdrl编码产物p-gp使之产生抗肿瘤药物能力,在高剂量药物化疗时,造血干细胞不受影响,而肿瘤细胞能够最大限度被杀死,但是造血干细胞转染效率较低,限制了这一技术的发展;人骨髓间充质干细胞（Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）由于具有:1、纠正或改善造血微环境的损伤,促进移植后造血和免疫功能的重建;2、免疫调节功能;3、易于外源基因的转染和表达;4、具有自我更新能力和多向分化潜能;5、易于分离培养等优点成为目前较理想的种子细胞,是细胞替代和基因治疗理想的细胞来源。基于上述认识,本课题利用携带绿色荧光蛋白的含人mdrl全长的cDNA慢病毒载体转染人骨髓间充干细胞,并检测转染后细胞对化疗药物的耐受能力。冀希为恶性血液病细胞治疗和基因治疗提供实验和理论依据,为多药耐药的逆转带来新的思路。本研究主要分为三个部分1、骨髓间充质干细胞的体外培养目的:探讨体外培养MSCs的方法和其生物学特性,为进一步进行细胞转染奠定工作基础。方法:密度梯度离心法及贴壁法分离MSCs,细胞生长至80%-100%融合时以1:2传代,同时绘制生长曲线,FACS进行表面标志物检测,体外进行定向诱导分化。结果:原代细胞培养18天长满整个培养瓶,经过传代后的细胞生长形态更均一、排列更为有序,提示细胞生长一代的周期及传代过程对纯化MSCs具一定作用。FACS测定表面标志物测定提示,CD34、HLA-DR标记阴性,分别为1.66%和1.19%;CD71、CD44为阳性,分别为77.79%和91.05%;体外成功定向诱导分化为脂肪细胞。结论:人MSCs在体外条件下生长稳定,多次传代后FACS检测标志物仍有表达,定向分化能力稳定,可作为稳定的细胞来源基础。2、携带绿色荧光标记的慢病毒载体介导的mdrl基因修饰的人骨髓间充干细胞及其生物学特性的研究目的:检测人骨髓间充质干细胞经转染后目的基因的表达情况和生物学特性,为进一步抗药性研究奠定基础。方法:携带绿色荧光标记的含人mdrl全长的cDNA慢病毒载体转染人骨髓间充干细胞,利用RT-PCR及WesternBlot检测转染后mdrl及p-gp在靶细胞的表达情况,流式细胞仪进行转染率的测定,罗丹明排泌实验检测p-gp功能活性。结果:流式细胞仪检测转染率达83.44%,RT-PCR及Western Blot证实外源性mdrl在靶细胞内有表达,罗丹明排泌实验证明所表达的蛋白具有功能活性。结论:慢病毒载体可高效转染人骨髓间充质干细胞,外源基因可较好表达,细胞原有生物学特性不发生改变。3、转基因骨髓间充质干细胞耐药性的测定目的:测定转染后细胞的耐药性是否得到显著提高。方法:已转染细胞加入不同浓度不同种类的化疗药物,MTT法检测吸光度值,计算相应药物的半数抑制浓度及耐药指数。结果:导入mdrl的MSCs相对于未转染的细胞,耐药性有所提高（P<0.01）。结论:转染后的MSCs耐受高浓度化疗药物的能力增强,为大剂量化疗在肿瘤治疗中的应用提供了有力证据。