禽流感是危害养禽业的重要传染病之一。目前对于禽流感防治主要采用全病毒灭活油佐剂疫苗,其优点是制备方便、效果确实。虽然灭活苗对控制禽流感的流行起到了非常重要的作用,但也存在一些难以克服的缺点,如不能克服母源抗体的干扰、不能有效激发细胞和黏膜免疫应答等。减毒沙门氏菌可作为疫苗载体,通过自然感染黏膜途径运送DNA疫苗至宿主特定的免疫器官和细胞,表达外源抗原,激发机体产生保护性的细胞、体液和黏膜免疫应答。减毒沙门氏菌作为载体运送禽流感DNA疫苗,为禽流感的防治带来新的思路和手段。DNA疫苗虽能同时激发黏膜免疫、全身免疫和保护性T细胞免疫应答,但与灭活疫苗相比, DNA疫苗产生的抗体水平仍然偏低。为此,本试验构建了以减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207为运送载体的重组菌SL7207(pmcDNA-HA)和SL7207(pCAGGS-HA) ,探讨携带H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA基因的DNA疫苗的重组菌与灭活疫苗联合免疫对鸡的协同保护作用,从而为DNA疫苗的研究和进一步更好地控制禽流感的发生和流行探索一条新的途径。1.携带H9亚型AIV DNA疫苗的减毒沙门氏菌的构建与鉴定首先根据GenBank中已发表的A型禽流感病毒HA全基因序列设计并合成了一对PCR引物,通过RT-PCR扩增了鸡源H9亚型AIV毒株A/chicken/Yang Zhou/N/2005(H9N2) HA基因。将上述PCR产物克隆入pcr2.1-T载体进行测序。序列分析结果表明,所克隆到的HA基因与已发表的HA序列核苷酸同源性高达99%,与原型毒株A/Turkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)核苷酸同源性为83%,具有型特异性。用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切HA基因,插入pmcDNA3.1的相应酶切位点,构建成pmcDNA3.1-HA。用HindⅢ和XhoⅠ双切pcr2.1-THA回收HA基因,将其插入到pET的相应酶切位点,获得重组质粒pET-HA。然后用BamHⅠ和XhoⅠ双切pET-HA回收HA基因,插入经BgIⅡ和XhoⅠ双切的pCAGGS载体,构建成pCAGGS-HA。转染COS-7细胞通过间接免疫荧光试验证实HA基因在该细胞中得到了表达,说明两种质粒可以用于体内试验。最后通过电转化方法将两种质粒pmcDNA3.1-HA、pCAGGS-HA分别导入鼠伤寒沙门氏菌SL7207,重组菌命名为SL7207(pmcDNA3.1-HA)和SL7207(pCAGGS-HA),为进一步进行体内安全性和免疫效力试验奠定了基础。2.携带H9亚型禽流感病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌与灭活疫苗联合免疫研究在商品代伊莎褐蛋鸡的免疫效力试验中,设立SL7207 (pmcDNA3.1-HA)免疫组、SL7207 (pCAGGS-HA)免疫组、SL7207 (pmcDNA3.1-HA) +灭活苗联合免疫组、SL7207 (pCAGGS-HA) +灭活苗联合免疫组、SL7207 (pmcDNA3.1)免疫组、SL7207 (pmcDNA3.1) +灭活苗联合免疫组、油苗免疫组和空白对照组。对首免后2周(16 d)和二免后2周(30 d)各试验组的血清样品进行测定,结果显示各试验组血清中抗H9亚型禽流感病毒抗体效价都较低,各组之间没有显著性差异(p>0.05)。加强免疫后两周(44 d),重组菌免疫组与空白对照组、空载体对照组的血清抗体效价都较低,各组之间的差异不显著(p>0.05),SL7207(pmcDNA3.1-HA) +灭活苗联合免疫组、SL7207 (pCAGGS-HA) +灭活苗联合免疫组的血清抗体水平增加明显,与重组菌免疫组及空白对照组、空载体对照组相比,存在显著差异(p<0.05),其中重组菌SL7207 (pCAGGS-HA) +灭活苗联合免疫组抗体效价最高。小肠黏膜抗体测定结果显示,在加强免疫后2周(44 d)重组菌免疫组和联合免疫组均可以检测到针对禽流感病毒HA蛋白的特异性黏膜抗体,与空载体SL7207(pcDNA3.1)免疫组、空白对照组以及油苗组之间存在显著性差异(p<0.05);其中,SL7207(pCAGGS-HA)免疫组的黏膜抗体效价最高。免疫保护试验结果显示,各重组菌免疫组均具有一定的保护率,与空载体SL7207 (pcDNA3.1)免疫组和空白对照组之间存在显著性差异(p<0.05)。重组菌和灭活苗联合免疫组的免疫保护率最高,达100%,高于SL7207(pmcDNA3.1-HA)免疫组和SL7207(pCAGGS-HA)免疫组及油苗组。