埃博霉素(epothilone)是一类来源于纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)具有潜在抗肿瘤活性的16元大环内酯化合物,其作用机理与紫杉醇(paclitaxel)类似,通过稳定微管,阻滞微管解聚,使有丝分裂停留在中期,从而诱导肿瘤细胞凋亡。相比于紫杉醇,埃博霉素分子结构简单,水溶性更佳,抗肿瘤活性更强。但由于纤维堆囊菌生长缓慢,易受污染,导致埃博霉素目前价格高昂,严重限制了其临床应用,由于缺乏纤维堆囊菌的有效遗传操作手段,利用其他的原核宿主来实现埃博霉素的异源表达成为了研究的热点。但埃博霉素的生物合成机制复杂,相关基因簇为56 Kb之大,GC含量在60%以上,传统的分子生物学技术对埃博霉素基因簇难以进行有效的编辑。本实验室课题组利用Red/ET同源重组技术构建了埃博霉素基因簇的转座载体,并将其导入到伯克氏菌(Burkholderia)DSM7029的基因组中,筛选得到了一株能合成埃博霉素的基因工程菌株伯克氏菌DSM7029::Tn5-km-epo,编号为G32。尽管本课题组成功的实现了埃博霉素的异源表达,但其产量不高,总产量仅为3.7μg/L。利用有效的遗传操作方法提高埃博霉素的异源表达产量成为了当务之急。潜在的埃博霉素转运蛋白基因是位于埃博霉素基因簇外围的orf3与orf14两个开放阅读框编码的基因,对其氨基酸序列进行同源比对发现Orf3与Orfl4可能是埃博霉素的跨膜运输载体蛋白,本研究探究了潜在的埃博霉素转运蛋白基因在G32中表达对产物中埃博霉素产量变化的影响,通过Red/ET同源重组技术构建埃博霉素转运蛋白基因表达载体,并将其转入基因工程菌株G32中,获得一株新的基因工程菌株G32::orfl4-orf3,通过HPLC/MS/MS检测,实验发现新的工程菌株埃博霉素产量比原始提高了1倍左右,结果表明,潜在转运蛋白基因的异源表达能有效促进伯克氏菌中埃博霉素的生物合成,为实现埃博霉素异源高效表达和探究潜在埃博霉素转运蛋白在埃博霉素次级代谢过程中的调控作用奠定了重要基础。源自天蓝色链霉菌A3(2)的丙酰CoA羧化酶基因(scpccAB基因)能在胞内将丙酰CoA羧化合成埃博霉素B、D的重要延伸单元,甲基丙二酰CoA。本文研究了丙酰CoA羧化酶基因G32中表达对产物中埃博霉素产量变化的影响,通过Red/ET同源重组技术构建丙酰CoA羧化酶基因表达载体,并将其转入到基因工程菌株G32中,获得一株新的基因工程菌株G32::scpccAB,通过HPLC/MS/MS检测,实验发现新的工程菌株埃博霉素B、D的产量比原始提高了 4倍左右,埃博霉素B、D所占的产物比例由原来的20%提高到了 40%。结果表明,丙酰CoA羧化酶基因的异源表达能有效促进伯克氏菌中甲基侧链产物(B、D)的生物合成,增大其代谢通量,为实现埃博霉素异源高效表达和选择性生物合成研究奠定了基础除以上两个基因,本研究还从增强转录,促进反应后修饰等方面,利用Red/ET同源重组技术构建7 kb的epoK基因表达载体,60 kb的自杀型基因打靶载体和70 kb的埃博霉素基因簇与丙酰CoA羧化酶基因转座载体,为后续实验中进一步提高埃博霉素异源表达产量提供了研究基础。本研究在伯克氏菌中对潜在转运蛋白基因和丙酰CoA基因进行了调控功能研究,利用定向遗传改造的方法成功构建了埃博霉素高产菌株,为实现埃博霉素异源高效表达和合成调控奠定了相关基础。