论文部分内容阅读
研究目的:随着白念珠菌耐药增多,导致念珠菌感染治愈率降低的现状正引起越来越多人的关注。法尼醇可以增加多种微生物对药物的易感性。近期研究显示法尼醇联合氟康唑可以增高白念珠菌生物膜的药物易感性。本研究探讨法尼醇调控的MAPK信号通路功能基因RAS1在白念珠菌生物膜药物易感性之间的关联,以及R4S1基因在法尼醇所调控白念珠菌生物膜药物易感性中的作用。研究方法:通过实时荧光定量PCR(q-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测法尼醇对白念珠菌生物膜MAPK通路相关基因和蛋白的调控作用,筛选法尼醇在MAPK信号通路中调控的功能基因RAS1。随后构建RAS1基因高表达质粒(pCaEXP-RAS1)。利用醋酸锂转化法将高表达质粒(pCaEXP-RAS1)转化进入野生菌株CAI4,构建R4S1基因高表达菌株(pCaEXP-RAS1-CAI4)。进而,研究分为野生菌株(pCaEXP-CAI4)法尼醇处理组、野生菌株(pCaEXP-CAI4)法尼醇未处理组、RAS1基因高表达菌株(pCaEXP-RAS1-CAI4)法尼醇处理组和R4S1基因高表达菌株(pCaEXP-R4S1-CAI4)法尼醇未处理组4组,采用XTT减低法检测比较上述4组白念珠菌生物膜对氟康唑的药物易感性。研究采用q-PCR和Western blot分析法尼醇对RAS1基因高表达菌株(pCaEXP-RAS1-CAI4)生物膜RAS1基因和蛋白表达的调控作用,并将上述研究结果与法尼醇对野生菌株(pCaEXP-CAI4)R4S1基因和蛋白表达进行比较。研究结果:法尼醇对白念珠菌生物膜MAPK信号通路相关基因和蛋白调控机制研究结果显示,法尼醇对基因存在调控作用。在6h白念珠菌生物膜时相,法尼醇对基因STE11、HST7和CPH1呈负向调控,对CEK2正向调控;12h白念珠菌生物膜时相,法尼醇对STE11呈负向调控,对CEK2、CPH1正向调控;在24 h生物膜,法尼醇对CEK1、STE11和CPH1呈负向调控。此外,研究发现法尼醇抑制白念珠菌生物膜MAPK信号通路RAS1基因和蛋白表达,而且,法尼醇对RAS1基因和蛋白表达的调控在白念珠菌生物膜的4个时相(6h、12h、24h和36h)均呈负向调控。因此,本研究选择了RAS1做为法尼醇调控MAPK信号通路的功能基因进行深入研究。随后,成功构建白念珠菌R4S1基因高表达质粒(pCaEXP-RAS1)。q-PCR检验RAS1基因在RAS1基因高表达菌株(pCaEXP-RAS1-CAI4)中的表达升高,证明RAS1基因高表达菌株(pCaEXP-RAS1-CAI4)构建成功。进而,药物易感性检测发现,12h和24h生物膜,RAS1基因高表达菌株(pCaEXP-RAS1-CAI4)对氟康唑药物易感性低于野生菌株(pCaEXP-CAI4);说明R4S1基因高表达可以增高白念珠菌生物膜耐药性。6h、12 h和24h生物膜,RAS1基因高表达菌株(pCaEXP-RAS1-CAI4)法尼醇处理组对氟康唑的易感性显著高于未处理对照组;24h生物膜,野生菌株(pCaEXP-CAI4)法尼醇处理组对氟康唑的易感性高于未处理对照组。当法尼醇对RAS1基因高表达菌株(pCaEXP-R4S1-CAI4)生物膜的作用浓度为200μM和300μM时,其抑制作用明显强于100μM。q-PCR结果显示,12h、24h和36h生物膜,RAS1基因高表达菌株(pCaEXP-RAS1-CAI4)法尼醇处理组较未处理对照组组的RAS1基因表达显著降低。Western blot结果显示,12h、24h和36h生物膜,RAS1基因高表达菌株(pCaEXP-RAS1-CAI4)法尼醇处理组较未处理对照组的RAS1蛋白表达水平均降低。结论:RAS1是白念珠菌生物膜耐药相关基因,RAS1高表达可以增高白念珠菌生物膜耐药性。法尼醇通过抑制RAS1基因和蛋白表达增高白念珠菌生物膜药物易感性,降低白念珠菌生物膜耐药性。RAS1基因高表达菌株(pCaEXP-RAS1-CAI4)法尼醇处理组RAS1基因和蛋白表达均降低,进一步证实法尼醇通过调控RAS1而达到改变白念珠菌生物膜药物易感性的作用。