论文部分内容阅读
马立克氏病(MD)是由血清1型马立克氏病毒(MDV-1)引起的鸡淋巴组织增生性传染病。鸡CD4~+T细胞最易被MDV感染转化,可经浸润在外周神经和内脏器官中形成T淋巴瘤并引起免疫抑制。MDV编码的基因参与MD肿瘤发生、MDV的感染与复制等过程,一些有关MD肿瘤的转录组和蛋白质组分析也揭示MDV可通过改变宿主细胞的组学促进致病。本实验的前期研究发现MDV编码的被膜蛋白UL36具有去泛素化酶活性,并在MD肿瘤细胞中高水平表达,此蛋白在MDV的复制、致瘤及传播中发挥重要作用。由于动物细胞内的蛋白质泛素化参与细胞周期、增殖、分化、凋亡和病毒感染等过程,我们推测MDV可能改变鸡CD4~+T淋巴细胞的泛素化组以促进肿瘤发生及免疫功能异常。因此,本研究对MD肿瘤细胞与鸡正常CD4~+T细胞的泛素化组差异进行了分析。本研究应用抗泛素化肽段(K-ε-GG)的单克隆抗体分离MD肿瘤细胞系MDCC-MSB1细胞和CD4~+T淋巴细胞中的泛素化多肽,然后应用质谱对多肽进行定量和定性分析,并应用生物信息学分析泛素化基序、结构域以及蛋白种类、定位、功能,及这些蛋白参与的重要信号通路。然后对一些泛素化水平发生了显著变化的关键蛋白进行了进一步的鉴定。结果发现,相比于CD4~+T淋巴细胞,MD肿瘤细胞中有717个蛋白的泛素化被上调,同时,778个蛋白的泛素化被下调。根据这些蛋白在细胞中的定位、功能、种类等统计分析发现,在泛素化受MDV显著影响的蛋白中,泛素化显著上调的蛋白与显著下调的蛋白的数量相近。其中,转移酶类尤其是丝氨酸/苏氨酸类蛋白酶的泛素化是MDV的主要作用靶点。经KEGG通路分析发现,MDV主要改变T细胞中的信号转导、免疫系统、癌症和感染性疾病等通路中的蛋白的泛素化。免疫印迹实验确定,这些通路中的CDK1、IL-18、PRKCB、ETV6和EST1蛋白的泛素化可被MDV显著上调或下调。作为细胞周期依赖性激酶,CDK1是细胞周期调控过程中的关键酶,参与细胞增殖的调控。本研究发现CDK1蛋白有9个Lys位点的泛素化显著上调,最高上调倍数达152倍。为了验证CDK1蛋白的具体泛素修饰位点,本研究设计构建pCDH-EF1α-CDK1载体及其突变体,应用重组慢病毒感染MSB细胞,利用Strep tag II标签分离外源表达的野生型及突变型CDK1蛋白,最后应用免疫印迹鉴定CDK1蛋白的泛素修饰情况。结果发现,外源表达的野生型和突变型CDK1蛋白在75 kDa条带处均可检测到泛素修饰,因此,我们推断CDK1的泛素化不仅发生在Lys残基上,还可能发生在其他残基上。本研究确定了MDV在致瘤过程中,改变了鸡CD4~+T细胞的泛素化组。这些研究结果为从泛素调控角度探索MDV的致病机理拓展了新的研究思路,为MD的防控提供了理论参考。