【摘 要】
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鱼类生殖细胞中的转录活性相关的功能分子不仅可以作为分子标记研究生殖细胞发育过程,也可为探究鱼类多倍化进化提供有意义的研究切入点。本实验是以鲫鲤杂交品系鱼为研究对象,包括原始亲本红鲫（RCC）和父本湘江野鲤（CC）、及异源二倍体鲫鲤杂交一代F1（F1）和多倍化子代异源四倍体鲫鲤（4n AT）。对转录活性标记因子RNA polymerase Ⅱ CTD repeat YSPTSPS（phosphor
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鱼类生殖细胞中的转录活性相关的功能分子不仅可以作为分子标记研究生殖细胞发育过程,也可为探究鱼类多倍化进化提供有意义的研究切入点。本实验是以鲫鲤杂交品系鱼为研究对象,包括原始亲本红鲫（RCC）和父本湘江野鲤（CC）、及异源二倍体鲫鲤杂交一代F1（F1）和多倍化子代异源四倍体鲫鲤（4n AT）。对转录活性标记因子RNA polymerase Ⅱ CTD repeat YSPTSPS（phosphor S5）（简写为RNA Pol Ⅱ CTD（S5））进行了体细胞和生殖细胞染色体免疫荧光定位和精巢免疫组化研究。另外,基于转录组对二倍体鱼和四倍体鱼的染色体区段基因表达频率进行了比较,系统研究了鲫鲤杂交鱼多倍化过程中转录活性位点的变化。本研究主要内容如下:（1）RNA Pol Ⅱ CTD（S5）免疫FISH在红鲫体细胞中的定位特征:红鲫体细胞信号数较多,且在数目上呈现一定的规律性。体细胞间期主要呈现38-76个信号,进入分裂期后,信号数明显减少,分裂前期呈现约21-28个信号,分裂中期呈现1-10个信号数。（2）RNA Pol Ⅱ CTD（S5）免疫FISH在红鲫、湘江野鲤,鲫鲤F1和异源四倍体鲫鲤生殖细胞中的定位特征:各生殖细胞在减数分裂不同阶段呈现规律性的定位信号,且不同类型鱼类在同一阶段的信号数比较无显著差异,具体为四种鱼都是减I前期细胞分裂相中信号数明显较多,呈现20-40个信号;到减Ⅰ中期细胞,信号数明显减少到2-5个信号,但减Ⅰ后期细胞信号数又稍有增加,可检测到8-10个信号;后续细胞相中,精子细胞可见1-2个信号,精子中无信号。值得一提的是,异源四倍体鲫鲤生殖细胞中各阶段的信号数和原始二倍体母本红鲫、原始二倍体父本湘江野鲤及鲫鲤F1的一致,并没有因为染色体倍性和数目增加导致相应信号数增加。（3）RNA Pol Ⅱ CTD（S5）在红鲫、鲫鲤F1和异源四倍体鲫鲤精巢中的免疫组化研究,可见该蛋白特异性表达在精原细胞及部分早前期初级精母细胞。在一年龄的红鲫精巢中仅可检测到少量呈抗体阳性的处于减I早前期初级精母细胞;发育阻滞中的1龄鲫鲤F1精巢检测到丰富的呈抗体阳性的分裂紊乱的初级精母细胞及生精小管外周上皮附近的精原细胞;在两性可育的1龄异源四倍体鲫鲤精巢中,检测到呈抗体阳性的精原细胞和少量早前期初级精母细胞。（4）基于转录组分析多倍化过程中基因表达频率变化:通过红鲫、鲫鲤F1和异源四倍体鲫鲤精巢转录组clean reads映射到红鲫和鲤参考基因组作图,比较了这三种鱼在染色体水平上的转录活性位点数目,对基因组10Kb区域的测序reads进行统计分析,发现红鲫、鲫鲤F1和异源四倍体鲫鲤的最高活性区域相似,如JChr20:24810001-24820001在三种鱼中都是高频率表达区间。异源四倍体鲫鲤并没有因为染色体加倍而出现相对较多的高频表达区间。这些线索提示,在异源四倍体初期,与红鲫和鲫鲤F1相比,异源四倍体鲫鲤精巢中转录活性位点在基因组区域中是保守的。综上所述,异源四倍体鲫鲤在红鲫和鲫鲤F1基因组区域具有相似的基因表达模式,但表达水平存在显著差异。该结果与染色体免疫FISH一致,值得深入研究。总之,该论文创新性运用转录活性标记分子RNA Pol Ⅱ CTD（S5）,通过免疫FISH和免疫组化实验系统的研究了其在鱼类多倍化过程中的作用,初步揭示了鲫鲤杂交鱼生殖细胞的转录活性相关的细胞学特征,还结合异源二倍体鲫鲤F1和异源四倍体精巢的转录组数据比较,分析了高频表达位点的染色体区间在二倍体鱼和四倍体鱼之间的关联性,揭示了多倍化未导致染色体转录活性高频率位点的增加。该研究将为探究多倍体基因组表达模式提供重要的基础依据,值得进一步深入。总之,该论文通过免疫FISH法检测染色体水平的转录活性,统计并比较异源二倍体鲫鲤F1和异源四倍体鲫鲤的RNA Pol Ⅱ CTD（S5）信号数变化情况。基于免疫FISH的实验结果,通过免疫组化技术,检测到RNA Pol Ⅱ CTD（S5）蛋白在精原细胞及早前期初级精母细胞中表达。利用转录组比对基因组,比较了不同倍性鱼基因组学中高频率的转录位点数。这些结果为理解异源多倍体化过程中转录活性的变化提供了新的思路,在鱼类遗传育种方面具有重要意义。
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