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组织因子途径抑制物—2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2),是一种带有kunitz型结构域的蛋白酶抑制剂。成熟的hTFPI-2(human TFPI-2)由富含酸性氨基酸的N端、串联的三个kunitz结构域和富含碱性氨基酸的C端组成。体外实验发现它能抑制胰蛋白酶、纤溶酶、糜蛋白酶、血浆缓激肽释放酶、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶G等多种蛋白酶的活性。研究表明hTFPI-2能够抑制乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、胶质细胞瘤等多种恶性肿瘤的侵袭转移,也能够抑制动脉粥样硬化斑块的脱落。因此,hTFPI-2有可能作为一种新型蛋白质药物,在治疗肿瘤转移和动脉粥样硬化并发症方面具有潜在的应用前景。但目前对hTFPI-2结构功能的了解还不十分清楚,极大地妨碍了它的应用。
第一个结构域(hTFPI-2/KD1)是hTFPI-2发挥对多种蛋白酶抑制活性的关键部位。所以对hTFPI-2/KD1的结构,功能及其关系的研究显得尤为重要。本论文利用傅立叶红外光谱、圆二色谱和拉曼光谱研究了hTFPI-2/KD1的二级结构。发现hTFPI-2/KD1含有约17％α-螺旋,24％β-伸展链,46％无规卷曲,13％的β-转角结构,以及ggg和tgt两种结构的二硫键。通过对hTFPI-2/KD1的光谱随温度变化情况的研究,我们发现hTFPI-2/KD1具有一定的热稳定性。在高温下hTFPI-2/KD1可以转变为一种中间态,当温度降低后又变回到正常构型。对hTFPI-2/KD1的生物学活性实验也证实了hTFPI-2/KD1在80℃下孵育5 min再恢复到室温后,仍保持了原有抑制纤溶酶的活性。
本论文还探索了采用酵母表达系统制备hTFPI-2第三个Kunitz结构域及C端(hTFPI-2/KD3C)的工艺路线。在突变了糖基化位点,并按照毕赤酵母密码子使用的偏好性优化了hTFPI-2/KD3C的编码基因的基础上,将优化的基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,用电转化的方法使重组质粒转入毕赤酵母体内,筛选出高拷贝的转化子。经发酵、表达和纯化后的目的蛋白纯度达到97％,产量为25mg/L左右。
在得到高纯度的hTFPI-2/KD3C样品后,本文首次在Bruker DMX500兆核磁共振仪上进行了hTFPI-2/KD3C的1H NMR实验,初步探讨了其结构和功能。利用hTFPI-1/KD3C与hTFPI-2/KD3C的高度同源性,我们从hTFPI-1/KD3C的已知结构功能入手,探讨了hTFPI-2/KD3C的结构与功能,实验表明hTFPI-2/KD3C具有与肝素结合的特性,NaCl可以封闭二者的结合,在此基础上我们初步分析了hTFPI-2/KD3C可能的肝素结合位点。