论文部分内容阅读
研究背景黑色素瘤是由于黑色素细胞不可控性恶性增殖而产生的一种恶性程度高、侵袭性强的皮肤肿瘤,占所有皮肤癌相关死亡人数的80%。在过去的几十年里,黑色素瘤的发病率急剧上升,在全球范围内,给人类的健康和经济带来了沉重的负担。黑色素瘤的治疗,依据肿瘤的不同分期有不同的治疗方法。在疾病早期,黑色素瘤通过外科手术切除即可有良好的预后,10年生存率达到93%;但是,一旦出现疾病进展,患者的中位生存期(MTS)在9.6-15.9个月之间不等,五年生存率低于10%,预后不佳。目前可供选择的治疗方案有化疗、放疗、分子靶向治疗、激光治疗、免疫治疗等。免疫治疗在黑色素瘤的治疗中获得了突破性的进展,其中所涉及的免疫检查点抑制剂的相关作用机制十分复杂,和机体免疫应答中的三个关键步骤有关,主要包括:抗原的呈递、抗原的有效识别、免疫细胞发挥免疫效应。体细胞恶性增殖转变为肿瘤的过程中产生肿瘤新抗原,从而被免疫系统识别而清除。具体过程为,内源性的肿瘤抗原被处理加工后以MHC-Ⅰ抗原肽复合物的形式被提呈到抗原呈递细胞APC的表面,与T细胞表面的TCR受体结合,同时T细胞的激活还需要免疫共刺激分子的参与,从而激发T细胞的免疫杀伤作用,启动免疫效应阶段。T细胞激活的同时会释放免疫共抑制分子,以维持机体的免疫平衡,避免产生多度的免疫损伤。PD-L1是主要位于免疫细胞和多种肿瘤细胞表面的一种免疫共抑制配体,与T细胞表面的PD-1结合发生相互作用,起到免疫刹车作用,防止过度的免疫反应,但同时PD-1/PD-L1轴是肿瘤细胞产生免疫逃避的重要机制。而大约在40-50%的恶性黑色素瘤细胞上表达有PD-L1跨膜蛋白,其高表达可能与免疫治疗耐药或无效有关。目前伊匹木单抗(Ipilimumab)和PD-1单克隆抗体等免疫治疗虽然在黑色素瘤和肺癌等多种肿瘤的治疗中获得了突破性进展,但仅有一部分患者对其能产生有效应答,总缓解率ORR在29%-40%之间。一旦黑色素瘤患者使用免疫治疗后出现耐药后进展或复发,目前尚无有效的药物进一步控制疾病的发生发展。因此需要科研工作者们寻找新的药物单独或联合PD-1单抗用于黑色素瘤患者的治疗,以控制疾病进展、提高患者的生活质量、延长寿命。目的本实验的研究目的旨在探讨通过流式实验筛选出的能降低黑色素瘤细胞表面PD-L1表达的药物fostamatinib(R788)其可能的抗黑色素瘤作用机制。运用Western Blot、Q-PCR等实验探讨其与JAK-STAT信号通路的联系;通过MTT实验,克隆形成实验,划痕实验和Transwell实验探讨fostamatinib(R788)对黑色素瘤细胞增殖、迁移等相关生物学功能的影响;T细胞共培养实验探讨其对T细胞的免疫杀伤作用的影响,以及fostamatinib(R788)单药和其与抗PD-1单抗联合用药在小鼠异种移植模型中的抑瘤作用。方法1.体外实验,运用流式筛选了115种小分子抑制剂,寻找能够有效降低黑色素瘤细胞PD-L1表达的药物。我们筛选出了具有代表意义的脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase Syk)抑制剂fostamatinib(R788)可以降低降低黑色素瘤细胞表面PD-L1的表达。2.MTT实验,克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验检测了fostamatinib(R788)对黑色素瘤细胞增殖、克隆形成能力、迁移等生物学功能的影响。3.体外实验,Q-PCR和Western Blot检测了fostamatinib(R788)降低黑色素瘤细胞PD-L1的表达与JAK-STAT信号通路的相互关系,此外Q-PCR实验还检测了fostamatinib(R788)对抗原处理、识别过程中的关键分子的影响。4.体外实验,T细胞杀伤共培养检测了经fostamatinib(R788)、INF-γ预处理24小时后,对T细胞的免疫杀伤作用的影响。5.体内实验,检测fostamatinib(R788)单独用药或和PD-1联合用药对小鼠异种移植瘤的抑瘤作用,并将剥离提取的肿瘤细胞流式分析肿瘤细胞中各免疫分子的浸润情况。结果1脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase Syk)抑制剂fostamatinib(R788)可能的是通过JAK-STAT信号通路降低PD-L1的表达。2.fostamatinib(R788)能够抑制黑色素瘤细胞的增殖、克隆形成能力及迁移。3.fostamatinib(R788)能够恢复INF-γ预处理肿瘤细胞对T细胞的敏感性,增加INF-γ的抑瘤效应。4.体内实验发现fostamatinib(R788)能够明显抑制小鼠黑色素瘤的生长,能够增强INF-γ的抑瘤作用,但是抑瘤效果并不优于PD-1单药治疗;和PD-1单抗联用,并不能增强PD-1的抑瘤作用。结论脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase Syk)抑制剂fostamatinib(R788)可能通过JAK-STAT信号通路降低黑色素瘤细胞PD-L1的表达,在体内外实验中能够明显抑制黑色素瘤的生长,能够增强INF-γ的抑瘤作用,有望成为黑色素瘤治疗的新的靶向药物。